Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø

10 Overlevelse af Gliocladium roseum under markforhold efter udbringning med frø

10 Overlevelse af Gliocladium roseum under markforhold efter udbringning med frø
10.1 Materialer og metoder
10.2 Resultater
10.3 Diskussion

Antagonisters evne til at kolonisere rodoverfladen og rhizosfæren af en kulturplante er en vigtig egenskab for effektiv biologisk bekæmpelse af jordbårne plantepatogener. I forbindelse med biologisk frøbejdsning anvendes ofte betegnelsen rhizosfære kompetence, der kan defineres som mikroorganismes evne til at kolonisere rodzonen efter applikation med frøet (Baker, 1991). For bekæmpelse af jordbårne patogener ved biologisk frøbejdsning synes rhizosfære kompetence også at være en meget betydende faktor. Eksempelvis er det for frøbejdsning med Trichoderma harzianum vist, at rhizosfære kompetente stammer af antagonisten fremkommet ved genetisk manipulation bekæmper jordbårne patogener som Pythium spp langt mere effektivt end ikke rhizosfære kompetente vildtype stammer (Harman et al., 1989; Baker 1991).

Formål

Formålet med nærværende eksperimenter er at undersøge om udsættelse af G. roseum (IK726) i marken ved frøbejdsning af byg og hvede influerer på den mængden G. roseum spiringsenheder (cfu pr. g rod), der kan reisoleres fra rhizosfære 5-8 måneder senere.

10.1 Materialer og metoder

Udsæd af byg ("Alis Abed") og hvede ("Sleipner") overfladesteriliseres og bejdses med G. roseum (IK726) efter standardprocedurerne beskrevet i kapitel 5.1. Kontrolbehandlinger behandles med vand. I bygforsøget udgøres parcellerne af 1 meters rækker med 4 gentagelser pr behandling. Hvedeforsøget udsås i parceller på 1 x 1 m med 8 gentagelser pr behandling. Fra vårbyg blev der indsamlet planter 5 måneder efter såning og fra hvede 8 måneder efter såning. Der blev opgravet 20 planter pr gentagelse svarende til i alt 80 planter/behandling for byg og 160 planter/behandling for hvede.

Rodvask

Kvantificering af IK726 ved hjælp af rodvask blev udført på følgende måde. Efter 1 døgns let tørring af planterne ved stuetemperatur børstes jorden af rødderne, der herefter afklippes og vejes. For hver gentagelse udtages 5 g rødder, der tilsættes 100 ml sterilt H2O og omrystes 1 time ved 150 rpm. Vaskevandet fortyndes op til 2 x 10-4 og herefter pladespredes 3 x 100 ml pr. fortynding på Trichoderma selektivt medium (TSM) (Elad & Chet, 1981). Pladerne inkuberes i mørke ved stuetemperatur og aflæses efter 14-20 dage. I tvivlstilfælde podes kolonier på PDA for identifikation.

10.2 Resultater

Af figur 10.1 fremgår det, at IK726 formodentlig er i stand til at overleve i rhizosfæren af byg og hvede i henholdsvis 5 og 8 måneder. Således blev der isoleret ca. 5 gange så mange cfu af G. roseum pr. g rod fra bygrødder og ca. 8 gange så mange cfu pr. g rod fra hvederødder fra de IK726 bejdsede forsøgsparceller ved sammenligning med isolering foretaget fra kontrol parceller (frø bejdset med vand).

cfu/g bygrødder	cfu/g hvederødder

Figur 10.1. Isolering af Gliocladium roseum på selektivt medium efter rodvask af byg og hvederødder henholdsvis 5 og 8 måneder efter såning af frø bejdset med G. roseum (IK726) eller vand.

Figure 10.1. Isolation of Glicladium roseum on selective medium after washing of roots of barley and wheat, respectively, 5 and 8 month after sowing seeds coated with G. roseum (IK726) or water.

10.3 Diskussion

Det kan konkluderes, at der genfindes en højere rodpopulation af G. roseum (cfu/g rod) i IK726 bejdsede parceller end i ubehandlede parceller af henholdsvis byg og hvede. Det indikerer alt andet lige, at isolatet er i stand til at kolonisere rødder af både byg og hvede. Det er ikke muligt ud fra forsøgene at fastslå om kolonisering er sket i hele rodnettets udstrækning. For andre kendte antagonister som eksempelvis T. harzianum kan isolater applikeret ved bejdsning oftest kun genfindes 1-2 cm under frøet, mens den resterende del af roden ikke koloniseres. For isolater af T. harzianum, der er rhizosfære kompetente, følger populationsdensiteten som oftest en C-formet kurve svarende til den højeste populationstæthed lige under frøet og mod rodspidsen (Ahmad & Baker, 1987). Knudsen (1994) undersøgte i klimakammer G. roseum isolatet IK726´s evne til at kolonisere bygrødder i sand og viste at, IK726 er i stand til at vokse fra frøet og kolonisere den nederste del af rodnettet. Forsøgene viste dog en koloniseringsgrad (cfu per g rod) der var ca 25x højere på den øvre del af rodnettet (0.5 cm under frøet) end på den nedre del af rodnettet (0.5 cm fra rodspidsen). På KVL arbejdes der i øjeblikket med at transformere IK726 med gfp genet, der gør at svampen bliver fluorescerende. Derved muliggøres en mere præcis monitering af isolatets aktivitet, kolonisering og overlevelse i rodzonen i laboratorieforsøg.

Ved pladespredning af rhizosfærejord på selektivt substrat, er det ikke muligt at skelne IK726 fra naturligt forekommende isolater af G. roseum. På KVL er en PCR-metode til specifik genkendelse af IK726 under udvikling. Repræsentanter for G. roseum isolater fundet ved rodvask af byg -og hvederødder og opbevaret på PDA i 10% glycerol ved -80·C er undersøgt ved hjælp to konstruerede primere, der med stor sandsynlighed specifikt kan identificere isolatet IK726. De foreløbige resultater tyder på, at IK726 har overlevet i rodzonen på byg, idet alle undersøgte isolater fra behandlede planter blev bestemt til at være IK726, mens et isolat fra kontrolparcellen ikke kunne identificeres som værende IK726.

Generelt synes antagonistiske svampeisolaters rhizosfære kompetance at være stærkt afhængig af plantearten, ligesom der kan være udtalte sortsforskelle (Sivan & Harman, 1991; Kortemaa et al.,1994). Der er ikke i litteraturen fundet yderligere undersøgelser, der understøtter at G. roseum er rhizosfære kompetent på korn eller andre kulturplanter. Ældre undersøgelser viser dog, at G. roseum under markforhold er en naturlig kolonisator af rodzonen af vigtige kulturplanter som ært, bønne og soyabønne (Buxton, 1957; Stenton, 1958; Dix, 1964; Mueller & Sinclair, 1986) samt planter tilhørende salturtfamilien (Pugh & Dickinson, 1965). Det er således sandsynligt, at IK726 er rhizosfære kompetent på andre kulturplanter end byg og hvede.