Miljøstyrelsens 12. Mikrobiologiske Metodeafprøvning

Bilag 7
Laboratoriernes bemærkninger til metodeforslaget

Lab. nr. 2

Bemærk at det ikke er lykkedes at bestemme 44°C kimtallet i prøve 3 og prøve 4. Det er ikke tale om en simpel forbytning mellem 10⁰ og 10 ^-1 - pladerne, så resultaterne er noteret, som de foreligger.

Lab. nr. 3

Angivelse af kimtal:

1. Ingen synlige kolonier bør angives" <10 gange laveste fortyndingsfaktor/ml".
2. Hvorfor gå tilbage til simpelt gennemsnit - vægtet gennemsnit som angivet af Miljøstyrelsen synes mere "retfærdigt".
3. I regneeksemplet angives antal talte kolonier med to decimaler.

Vi har anvendt petriskåle uden ribber indpakket i plastposer. Der var ikke problemer med udtørring.

Lab. nr. 4

Fortyndingsvæske: Pepton 1 g, NaCl 8,5 g
Demineraliseret vand 1000 ml. pH indstillet på 7,2 før auto.

Lab. nr. 6

1. Alle ca. tal er beregnet ud fra ¼ talt plade.
2. Alle plader v/65°C var delvis tørret ud, men det var stadig muligt af aflæse.

Alle plader har været pakket ind i 2-3 poser samt fået et sterilt filter i låget.

• pH blev indstillet til 7,7 ± 0,2 efter autoklavering, da den ikke passede.
• Alle resultater er beregnet ud fra tælletal mellem 10 og 250.

Der er på dette område ikke helt overensstemmelse mellem forskellige angivelser i metodeforslaget. En specificering under pkt. 8.1, 1. linie og pkt. 8.1, regneeksemplet er således ønskeligt.

Lab. nr. 7

Dyrkningssubstrat R2A-agar
pH i substratet, som har været anvendt, er målt til 7,2
Ved en misforståelse er substrat ikke blevet fremstillet med pH 7,7

Lab. nr. 8

Dyrkningssubstrat: pH ville efter flere forsøg ikke højere op end 7,47 efter autoklaveringen.

Lab. nr. 9

Dyrkningssubstrat: pH i det færdige substrat er målt til 7,33, trods indstilling af pH til 7,74 før autoklavering.

Beregning og angivelse af kimtal.
Der er talt på alle plader med kolonital fra 10 til 250.
Det er uklart i forskriften hvilke kimtal der skal tælles.

1. Der tælles på alle plader med kolonital op til 250.
2. Tælletal mellem 1 og 10: angives <10.

Kimtallet er udregnet "vægtet" i forhold til den udsåede mængde.
Laboratoriet har således ikke anvendt den beregningsmetode som er anvist i 7.1.

Lab. nr. 10

Laboranterne havde problemer ved fremstilling af substratet, idet de havde overset, at pH skulle indstilles til 7,7 ± 0,2.
Dette blev så gjort efter autoklavering og kan være den mulige årsag til forureningen af prøverne.
Denne fejl kan undgås ved, at substratet har det rette pH fra fabrikantens side. Så vil usikkerheden mellem laboratorierne også blive mindre.

Et andet problem var udtørring af pladerne. Pladerne var indpakket i plastposer.
Der blev dagligt, nogle gange to gange dagligt, hældt vand i bunden af varmeskabene for at opretholde en vis fugtighed.
Da laboratoriet ikke har week-end vagter, blev dette ikke udført lørdag/søndag.

Lab. nr. 11

Dyrkningssubstrat: R₂ agar blev indstillet på pH 7,80 før autoklavering.
pH efter autoklavering var 7,41.
Der hældes mindst 15 ml agar på skålene.

Lab. nr. 12

Pkt. 8.1 Beregning og angivelse af kimtal

A

B
Det kan undre, at kimtal fra flere plader med tælletal 10-250 opgøres som det aritmetriske gennemsnit og ikke som det vægtede gennemsnit, som angivet i NMKL Rapport nr. 5, 1994.

Lab. nr. 13

Dyrkningssubstrat:

306 58977 indeholder ikke Casamino acids

Lab. nr. 14

Dyrkningssubstrat: R₂A pH 7,2 +/- 0,2
Temperaturen i 65°C termostat har været mellem 63 og 65°C. (altså 64,0 +/- 1°C).

Lab. nr. 16

Dyrkningssubtrat: Indhold af Natriumpyrovat = 0,3 g/1000 ml.

• Lidt problemer med kondensvand ved inkubering ved 65°C. Kan evt. afhjælpes ved at lægge sterilt trækpapir i låget?
• Ønskes pH = 7,7 i R₂A-agar, er det et stort ønske, at substratet findes kommercielt tilgængeligt med denne pH-værdi. Det har ved denne metodeafprøvning været vanskeligt at indstille til den ønskede pH-værdi.
• Dybdeudsæd, som foreslået i denne metode, er klart at foretrække fremfor overfladeudsæd, som angivet i tidligere forslag.

Lab. nr. 18

Dyrkningssubstrat:

• som angivet i 5.2, dog 0,3 g Sodium Pyruvat i stedet for 0,5 g

Fortyndingsvæske:

• som angivet i 5.1.1, dog + dinatriumhydrogenphosphat 0,3 g

Lab. nr. 19

Dyrkningssubstrat: Afvigelser på pH:
Anvendt pH: 7,15
Anbefalet pH: 7,7 ± 0,2
Sodium Pyrovate i anv.subst:. 0,3 g
Sodium Pyrovate i anb.subst. 0,5 g
Fortyndingsvæske:
Anvendt autoklavering: 115°C/15 min.
Anbefalet autoklavering: 121°C/15 min.

Lab. nr. 21

Dyrkningssubstrat: pH kun 7,33
Der konstateredes stærk udtørring af pladerne inkuberet ved 65 grader.
Pladerne var ikke helt indtørrede, og kolonierne var lette at tælle.

Pladerne var lagt i plastposer, der var foldet en gang - ikke klæbet til.
Der var ikke blæser i termostatskabet.

Lab. nr. 25

Fortyndingsvæske: pH = 7,0 ± 0,2 før autoklavering
Dyrkningssubstrat: pH 7,2 ± 0,2 efter autoklavering.
Bem. til punkt 5.1 pH i fortyndingsvæske efter autoklavering er ikke opgivet.
Bem. til punkt 6.1. Temperatur 46°C ± 1°C !
Alle øvrige laboratoriehenvisninger er 45°C ± 1°C.

Lab. nr. 26

Dyrkningssubstrat: Difco's R₂A agar indeholder 0,3 g
Natriumpyrovat pr. ltr. og ikke som anført i metoden (pkt. 5.2) 0,5 g/l.

De anvendte store plastposer til indpakning af pladerne under inkuberingen havde en tykkelse på 0,008 mm, hvilket ikke har været tilstrækkeligt til at undgå uønsket fordampning. Substratet på enkelte plader inkuberet ved 55°C var udtørret i let grad, mens både substrat og kolonier på flere plader inkuberet ved 65°C var udtørret i svær grad. Kolonierne kunne aflæses, men det vurderes, at en sådan udtørring kan påvirke resultatet.

Det bør i metoden være nævnt, at plastposerne skal have en tilstrækkelig tykkelse, f.eks. 0,07 mm som stomacherposer eller 0,02 mm som frostposer. Ved rekvirerede prøver til undersøgelse for Thermus bakterier (65°C/4 døgn), hvor kun få plader inkuberes, anvender vi stomacherposer uden problemer med udtørring.

Til opsamling af kondensvand anvender vi med god erfaring ved rekvirerede prøver filterpapir i låget på petriskålen, men som følge af udtørringen har dette princip ikke haft virkning ved metodeafprøvningen.

I de tilfælde, hvor der er anvendt 2 plader til beregning af resultatet, er kimtallet udregnet for hver plade, hvorefter der er taget et simpelt gennemsnit, jf. kap. 8.1 i metoden. Denne beregning virker imidlertid lidt paradoksal i en tid, hvor vi ved andre nye forskrifter bliver præget til at beregne kimtallet ved addition af kolonitallene og division med udsædsmængden, hvorved kolonitallet fra en højere fortynding tillægges mindre værdi. Følgende resultater, hvor den sidstnævnte beregningsmetode er anvendt, skal anføres:

• prøve 1, 44°C: 9300,
• prøve 4, 37°C: 1200,

Det er uhensigtsmæssigt, at der skal ændres på pH ved fremstillingen af R₂A agar. Fabrikantens anvisning er 7,2 +/- og metoden anfører 7,7 +/- 0,2.

Lab. nr. 27

Dyrkningssubstrat: Der er 0,2 g Sodium Pyrovat mindre end forskriften anbefaler.
Der sker en stor fordampning ved 65°C, selv om skålene inkuberes i plastposer.

Lab. nr. 28

Dyrkningssubstrat:
Substratet indeholder: Tryptone 0,25 g + pepton 0,75 g i stedet for :
Proteose pepton3 - 0,5 g + Casamino Acid 0,5 g
Natrium pyrovat: 0,3 g i stedet for: 0,5 g
Magnesiumsulfat: 0,024 g i stedet for: 0,05 g

Lab. nr. 29

Dyrkningssubstrat: Substrat lånt af MLK, Odense.

Lab. nr. 31

Pladerne kunne nemt tælles op til 300 kolonier. Det er nemmere at tælle på dybdeudsæd end på overfladeudsæd.

Lab. nr. 32

Dyrkningssubstrat: Slut pH ved 25°: 7,63.
Fortyndingsrække: Der er anvendt ionbyttet H₂O med ledningsevne <1 mS/cm