Alternativer til dyreforsøg for øjenirritation.

2. Rekonstruerede vævsmodeller

Der er udviklet en lang række in vitro modeller med væv, der er rekonstrueret ud fra celler fra menneskelig hud. Der anvendes f.eks. øjenmodeller, der fungerer som en model for hornhindens epithelvæv eller er et kombineret epithel og støttevæv (stroma). En række hudmodeller er opbygget på tilsvarende måde, men her er også opbygget et hornlag (stratum corneum). Modellernes lighed med normalt væv giver mulighed for en lang række praktiske anvendelser indenfor toksikologien og farmakologien (Rasmussen, 1996). Forsøg med rekonstruerede vævsmodellerne har foreløbigt givet gode overensstemmelser til resultater fra dyreforsøg ved test-ning af mange forskellige typer stoffer og produkter for øjen- og hudirritation, ætsning og fototoksicitet. Vævsmodeller anvendes tillige ved undersøgelser af hudens udvikling og sårheling samt i vurdering af anti-ældnings midler og solbeskyttende præparaters effekt.

2.1 Rekonstruktion af væv

Rekonstrueret hud er udviklet til behandling af store brandsår, hvor det ikke er muligt at anvende patientens egen hud til transplantation. Både rent kemisk fremstillede systemer, som skumplader fremstillet af makromolekyler fra huden, og biologiske modeller med levende hudceller er blevet brugt. Dyrkning af overhudsceller (keratinocyter) direkte på sårbunden ved større forbrændinger kan føre til sårsammentrækning, og forudgående brug af en kunstig underhud (dermis) har vist sig at give en betydeligt bedre sårheling. På den kunstige dermis udsås 4-6 cellelag tykke kulturer (væv) af keratinocyter. Hormoner og andre vækstfaktorer tilføres fra patientens krop, og keratinocyterne danner et fuldt udviklet epithel med hornlag.

Rekonstruerede hudmodeller indeholder typisk enten udelukkende keratino-cyter eller kombinationer af fibroblaster og keratinocyter, og de repræsenterer derfor et meget forenklet system sammenlignet med in vivo situationen. Den store udfordring ved konstruktion af hudmodellerne har været at frembringe en flerlaget epidermis med stratum corneum uden hjælp fra en levende organisme. Keratinocyter udsås på filtre eller andre substrater, og danner herpå et sammenhængende lag af basalceller. Hvis processen stoppes her, er der konstrueret en øjenmodel. Hvis cellekulturerne bagefter udsættes for luft, dannes der et flerlaget epidermalt væv, der dækkes af et tyndt hornlag. Herved er der dannet en hudmodel. Den kunstige epidermis består af tilsvarende lag af keratinocyter som den naturlige, og en vellignende ultrastruktur er påvist ved lys- og elektronmikroskopi.

Vævsmodellerne kan bruges til studier af keratinocyternes differentiering, herunder af forandringer af profiler af proteiner og fedtstoffer. Der er påvist en stor biokemisk lighed mellem modellerne og normal hud, men vævs-modellerne adskiller sig dog også på flere punkter markant strukturelt og biokemisk fra in vivo situationen. Der er specielt store forskelle i den relative forekomst af forskellige fedtstoffer og i deres strukturelle organisering og fordeling. Desuden sker der en høj grad af diffusion gennem de ikke fuldt forhornede celler i stratum corneum in vitro.

Flere vævsmodeller består udelukkende af epidermalt væv dyrket på døde erstatninger for dermis som f.eks. deepidermiseret dermis, mikroporøse filtre, eller en kollagenmatriks. Tilstedeværelsen af en levende dermis har dog formentlig stor betydning for vævets funktioner. Under sårheling in vitro bliver keratinocyternes vækst markant øget ved tilstedeværelsen af epidermal vækstfaktor, og af stoffer der udskilles af basalmembranen og fibroblaster. Forekomsten af et epithel, en basalmembran og et bindevæv i in vitro modellerne kan tillige bruges ved vurdering af, om læsioner vil kunne heles uden varig skadevirkning. Når kun de ydre dele af et epithel beskadiges, er konsekvenserne generelt små, fordi vævet er i stand til at regenerere. Hvis basalmembranen og stroma også beskadiges, kan der opstå permanente skader.

En levende dermis kan konstrueres på flere måder. Celler fra dermis (fibroblaster) kan f.eks. indstøbes i en gel af kollagenfibre og vævs-kulturmedium. Cellerne hæfter sig hurtigt fast til kollagenfibrene, gelen trækkes herved sammen og mediet udstødes. Efter 2-3 dage i kultur dannes en tæt plade af hvidt, kondenseret væv, der er et egnet grundlag for dyrkning af epidermale celler. Levende dermalt væv kan ligeledes fremstilles ved dyrkning af fibroblaster på nylonnet med mikroskopiske masker. Cellerne hæfter sig fast til nettet, de udskiller forskellige dermale matriksmolekyler, og vævet fylder gradvist nettets masker. Herved dannes der et tre-dimensionelt bindevæv, hvorpå andre celletyper kan dyrkes.

En serie af modeller har haft fibroblastvæv dyrket på nylonnet som basis. En SKIN² ZK 1100 model består udelukkende af fibroblastvæv. I SKIN² ZK1200 øjenmodellen er dette bindevæv suppleret med 3-4 lag keratinocyter. Vævet er en model for hornhinden, der har et lag af epidermale celler af tilsvarende tykkelse. SKIN² ZK 1300 systemer med hornlag har været anvendt som hudmodeller. En model med humane slimhindeceller fra mundhulen er blevet brugt til test af materialer til tandbehandling. Hudvæv opbygget på biologisk nedbrydelige net er udviklet til brug ved transplantationer.

Vævsmodellerne er metabolisk aktive, og de kan yderligere bruges til at undersøge effekter af samspillet mellem forskellige celletyper. Forsøg med dyrkning af pigmentdannende celler (melanocyter) i flerlagede keratinocytkulturer har vist, at flere karakteriske træk fra in vivo situationen kan genskabes. Melanocyterne etablerer sig i det basale keratinocytlag, og de begynder at producere pigmentet melanin. Efter UV-bestråling øges vævets pigmentering. En sådan model er vurderet som meget velegnet til test af stoffers og produkters fototoksiske eller solbeskyttende virkning.

Påvirkning af væv med lokalirriterende stoffer og UV-stråling kan ændre cellernes enzymaktivitet og vækstmønster samt medføre udskillelse af irritationsmarkører som prostaglandiner, leukotriener og cytokiner. I gennem en længere årrække er målinger af sådanne parametre i traditionelt dyrkede cellekulturer blevet vurderet som mulige alternativer til dyreforsøg ved testning af stoffers lokalirriterende effekter. Generelt har resultater fra sådanne systemer været i god overensstemmelse med in vivo øjenirritationsdata for vandopløselige forbindelser, men ved en række større blindundersøgelser af blandede stoffer og materialer har metoderne dog vist sig at være fuldstændig utilstrækkelige til forudsigelse af in vivo responset. Forsøg med øjenmodeller af rekonstrueret væv er nu blandt de mest lovende alternativer til dyreforsøg. En række procedurer med vævsmodeller er også udviklet til brug ved testning for ætsning, hudirritation og fototoksicitet, og sådanne metoder er under yderligere validering.