| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Nedbrydning og sorption af dichlobenil og BAM-litteraturopsamling samt laboratorieforsøg

5 Nedbrydningsforsøg

Ved vurdering af en forurenings varighed er det udover sorption til sedimentet nødvendigt at kende nedbrydningshastigheden for det aktuelle stof. Denne kvantificeres ofte ved halveringstider, DT₅₀, der typisk bestemmes udfra en 0.-ordens (lineært aftagende koncentration) eller 1.-ordens (nedbrydningshastighed proportional med koncentrationen) kinetik. Nedbrydning af pesticider kan foregå både abiotisk og biotisk (mikrobielt), men ud fra litteraturen synes mikrobielle nedbrydningsprocesser at være dominerende (Helweg, 1983). Både abiotisk og mikrobiel nedbrydning afhænger af parametre som: Sedimentsammensætning, pesticidkoncentration, temperatur, fugtighed, pH og redoxforhold. Desuden afhænger mikrobiel nedbrydning af arten og antallet af mikroorganismer.

Ved en pesticidforurening løser en primær nedbrydning af et stof ikke nødvendigvis problemet, idet nedbrydningsproduktet kan være ligeså uønsket i miljøet som moderstoffet. Ofte kan kun total mineralisering af stoffet fjerne problemet. En pålidelig risikovurdering må således baseres på resultater fra forsøg med såvel overjord som grundvandssediment under velbeskrevne forhold og udført ved relevante koncentrationer og temperaturer. I forbindelse med dette projekt er der derfor i laboratoriet udført en række nedbrydningsforsøg med henblik på at opnå pålidelige nedbrydningsdata for dichlobenil og nedbrydningsproduktet BAM. I forsøgene er anvendt sediment og vand fra Staurbyskov, Eskærhøj og Hvidovre fra de samme dybder som anvendt til sortionsforsøgene (figur 3, tabel 5), således at nedbrydningens afhængighed af sorptionen kan vurderes.

5.1 Metode

5.1.1 Opsætning af inkubationer med dichlobenil og BAM

Nedbrydningsforsøgene er udført som batch-inkubationer ved 10± 1°C i mørke. Prøvematerialet er udtaget i 36 mm plastrør vha. en Geoprobeâ kernetager. Kernerne er straks efter udtagning lukket med plastpropper, og anaerobe kerner er indpakket i aluminiumsfolie for at minimere diffusionen af ilt gennem plastrøret. Alle kerner er opbevaret ved 10°C i mørke indtil brug. Ved oplukningen er den yderste 1 cm fra hver ende skåret væk og resten af sedimentet fra kernen opblandet. Vand fra de pågældende dybder er tilsat, så sedimentet vandmættes. Ved opsætning af inkubationerne er 100,0 g vandmættet sediment overført til 118 ml hætteglas (syreskyllet og glødet ved 550°C), som er lukket med butylgummisepta med teflonindlæg. For de anaerobe kerner er sedimentoverførslen til hætteglas foretaget i en anaerob handskeboks (95-99% N₂, 1-5% H₂). For at fjerne H₂ er sedimentet efter overførslen gennemskyllet med oxygen-filtreret N₂. Herefter er der til hver hætteglas tilsat 50 ml grundvand fra de pågældende dybder. Det anaerobe grundvand er overført via teflonslange under iltfrit N₂-tryk. Efter mindst 1 døgns henstand er tilsat ca. 1 ml sterilfiltreret opløsning af ¹⁴C-mærket stof, således at initialkoncentrationen for dichlobenil er 100 µg/l og for BAM 10 µg/l. For hvert dybdeinterval er reproducerbarheden undersøgt ved opsætning af to identiske batch-inkubationer, ligesom en steriliseret kontrol (autoklaveret 3 x 30 min.) er medtaget for at belyse en evt. mikrobiel nedbrydnings betydning i forhold til en abiotiske nedbrydning. Vandindholdet i sedimentet fra hver inkubation er bestemt ved tørring i 24 timer ved 105°C. Det gennemsnitlige vandindhold i sedimentet er 20% ± 5%, dvs. hver inkubation indeholder ca. 80 g tørt sediment og 70 ml grundvand. En oversigt over alle opsatte inkubationer med angivelse af sedimentindhold, initialt vandindhold og initialkoncentration ses i bilag B.

5.1.2 Prøvetagning og måling

Inkubationerne med sediment fra Staurbyskov og Eskærhøj er prøvetaget i perioden 1 - 436 døgn efter opsætning, mens inkubationer med sediment fra Hvidovre er prøvetaget i perioden 7 - 372 døgn efter opsætning. Dagen før prøvetagning er inkubationerne forsigtigt rystet, indtil alt sediment var suspenderet. Ved prøvetagning er der udtaget ca. 1,8 ml fra inkubationer med dichlobenil og ca. 1,5 ml fra inkubationer med BAM i en polypropylensprøjte gennem en flammesteriliseret kanyle. Ved prøvetagning af anaerobe inkubationer er sprøjte og nål skyllet med iltfrit N₂ før brug. Prøverne er filtreret gennem 0,2 µm teflonfiltre (Advantec/MFS 13 HP), idet indledende forsøg har vist, at dichlobenil og BAM ikke tilbageholdes væsentligt i denne filtertype. Efter filtrering overføres 1 ml til scintillationsvials, og den ¹⁴C-mærkede koncentration er målt som beskrevet i afsnit 4.1. For inkubationer med dichlobenil er den resterende mængde prøve fortyndet i glasvials (syreskyllet og glødet ved 550°C), så koncentrationen af BAM er mindre end 1 µg/l, hvorefter koncentrationen af dannet BAM er bestemt vha. immunkemisk analyse udført af GEUS (Bruun, 1998). I løbet af forsøgene er alle inkubationer jævnligt omrystet og trykudlignet, og headspace er udskiftet med luft eller for anaerobe inkubationer med iltfrit N₂.

5.1.3 Opsamling af ¹⁴CO₂ fra udvalgte inkubationer.

For at detekterer en evt. mineralisering af BAM er der efter sidste prøvetagningsdag opsamlet ¹⁴CO₂ fra udvalgte inkubationer. ¹⁴CO₂ opsamles vha. en passiv CO₂-fælde, der består af et forbindelsesled af et rustfrit stålrør, der går gennem en butylgummiprop, hvorpå der er monteret en 20 ml scintillationsvial indeholdende 10 ml CarbosorbE. Tætheden af systemet er testet under N₂-tryk. pH sænkes til under 2 ved indsprøjtning af 2,5 ml 6 M HCl, så stort set alt carbonat findes i gasfasen hvorefter den opsamlede ¹⁴CO₂ måles ved scintillationstælling. pH er under forsøget jævnligt checket og justeret. Den totale mængde BAM der er mineraliseret, er beregnet som den relative forskel mellem den initiale aktivitet tilsat inkubationerne og den målte aktivitet i CO₂-fælden.

5.2 Databehandling

5.2.1 Dichlobenil inkubationer

I inkubationer med dichlobenil er målt den ¹⁴C-mærkede koncentration samt koncentrationen af dannet BAM. Koncentrationen af dichlobenil estimeres herefter som differensen mellem de to målinger. Det forudsættes derfor, at der ikke forekommer andre betydende nedbrydningsprodukter, samt at hastigheden af den videre nedbrydning af BAM er ubetydelig i forhold til nedbrydningen af dichlobenil.

Den totale mængde dichlobenil i en given inkubation til et givet tidspunkt beregnes af:

m_DIC = V_H2O(C_INI – C_BAM) – c_DIC –c_BAM – m_sedimentK_d,BAMC_BAM

hvor V_H2O (l) er vandmængden, C_INI (mmol/l) er initialkoncentrationen af dichlobenil, C_BAM (mmol/l) er den målte koncentration af BAM, c_DIC (mmol) og c_BAM (mmol) er den mængde af hhv. dichlobenil og BAM, der er fjernet fra inkubationerne ved prøvetagninger, m_sediment (kg) er massen af sedimentet, og K_d,BAM (l/kg) er den lineære sorptionskoefficient for BAM målt ved sorptionsforsøg med det aktuelle sediment (tabel 10). Mængden af tidligere fjernet stof samt aktuelt vandindhold beregnes kumulativt for hver ny prøvetagning. Bemærk, at sidste led i ovenstående udtryk repræsenterer den mængde BAM, der sidder sorberet til sedimentet i en given inkubation.

Tilsvarende kan den totale mængde BAM i en given inkubation med dichlobenil beregnes:

m_BAM = V_H2O C_BAM + m_sedimentK_d,BAMC_BAM

Forløbet af nedbrydningen kan udtrykkes ved C/C₀, hvor C er den totale mængde dichlobenil i en given inkubation, og C₀ er summen af dichlobenil og nedbrydningsprodukt til samme tidspunkt, dvs.:

C/C₀ = m_DIC/(m_DIC + m_BAM)

Ved denne udregning indgår således ikke stof, der allerede er fjernet fra systemet, hvilket ville være tilfældet, hvis initialkoncentrationen af dichlobenil indgik som C₀. Ud fra et plot af C/C₀ kan 0.- og 1.-ordens konstanter beregnes, idet der foretages hhv. lineær og eksponentiel regression med (0,1) som tvungent skæringspunkt. Dette resulterer i ligninger af formen:

0.-orden: C/C₀ = –kt + 1

hvor DT₅₀ = 0,5/k.

1.-orden: C/C₀ = e^–kt

hvor DT₅₀ = ln2/k.

Såfremt der i løbet af et forsøg er omdannet mindre end 0,5% dichlobenil til BAM, angives DT₅₀ som ikke målelig. I disse tilfælde er der tale om halveringstider større end 120 år. At der dog er tale om en minimal produktion af BAM ses ved at udtrykke nedbrydningen som mængde dannet BAM pr. gram sediment, S_BAM.(µg/g):

S_BAM = (m_BAM + c_BAM)/m_sediment

Heri indgår altså også det relativt meget lille kvantum BAM, der fjernes fra systemet ved hver prøvetagning.

5.2.2. BAM inkubationer

I inkubationer med BAM måles den ¹⁴C-mærkede koncentration ved scintillationstælling. Idet den anvendte BAM er mærket i sidekæden, vil koncentrationen af både BAM og evt. dannet 2,6-dichlorbenzoesyre blive målt ved denne metode. Et fald i ¹⁴C-koncentration i væskefasen kan derfor enten skyldes sorption eller en mineralisering af sidekæden i benzoesyren, som dog ud fra litteraturen menes at være hurtig. For at kunne konstatere en evt. signifikant ¹⁴C-mineralisering, er resultaterne fra inkubationerne med BAM præsenteret som ¹⁴C-koncentration versus tid. For at skelne mellem langsom sorptionskinetik og nedbrydning, er den teoretiske ligevægtskoncentration i væskefasen efter sorption, C_V, beregnet vha:

hvor V_H2O,INI er initialvolumenet af vand, og de øvrige parametre er som tidligere defineret. Ligevægtskoncentrationen i væskefasen efter sorption er i plots med den ¹⁴C-koncentration versus tid optegnet med 95% konfidensinterval.

5.3 Resultater

5.3.1 Nedbrydning af dichlobenil

Resultater fra nedbrydningsforsøg med dichlobenil på sediment udtaget ved Staurbyskov viser, at nedbrydningen af dichlobenil til BAM i muldlaget (0-0,25 mut.) er begrænset, idet der her kun er omsat ca. 5% efter en forsøgsperiode på 436 døgn (figur 9). I sedimenter udtaget 0,25-0,50 mut. og 0,50-0,75 mut. foregår nedbrydningen væsentlig hurtigere, idet der her er omsat mellem 75 og 88% dichlobenil (figur 9). I sediment udtaget længere nede i den umættede zone aftager nedbrydningshastigheden kraftigt med dybden. I sediment fra 2,52-3,70 mut. er der kun omsat mellem 15-20% efter 436 døgn, og nederst i den umættede og øverst i den mættede zone (4,96-6,18 mut.) detekteres der en særdeles langsom nedbrydning hvor kun 1,7 til 2,1% er omsat. I den mættede zone er ikke detekteret en nedbrydning af betydning. Samme tendens ses i inkubationer med sediment fra Eskærhøj (figur 10). Her foregår nedbrydningen dog hurtigere i overjorden (20-24% omsat til BAM efter 436 døgn) end for overjorden udtaget ved Staurbyskov. I sedimenter udtaget 0,25-0,5 og 0,5-0,75 mut. ved Eskærhøj ses igen den hurtigste nedbrydning, idet der her er omsat mellem 63-72% efter 436 døgn, mens nedbrydningen længere nede er særdeles begrænset. For Hvidovre-sedimenterne (aerob og anaerob moræneler samt kalk) ses kun en meget begrænset nedbrydning i den aerobe moræneler (0,9-1,4%), mens der ikke forekommer en signifikant nedbrydning i den anaerobe ler eller i kalken (figur 11).

Se her!

Figur 9.
Nedbrydning af dichlobenil til BAM i sediment fra Staurbyskov udtrykt som C/C₀. DIC-I og DIC-II repræsenterer to duplikater, mens kontrollen er en autoklaveret inkubation.
  

Se her!

Figur 10.
Nedbrydning af dichlobenil til BAM over tid i sediment fra Eskærhøj udtrykt som C/C₀. DIC-I og DIC-II repræsenterer to duplikater, mens kontrollen er en autoklaveret inkubation.
  

Se her!

Figur 11.
Nedbrydning af dichlobenil til BAM i sediment fra Hvidovre udtrykt som C/C₀. DIC-I og DIC-II repræsenterer to duplikater, mens kontrollen er en autoklaveret inkubation.

Generelt er der ikke detekteret signifikant nedbrydning i de autoklaverede kontrol-inkubationer (figur 9-11), og nedbrydningen foregår derfor primært ved mikrobiel katalyseret hydrolyse. Endvidere ses, at den primære nedbrydning fra dichlobenil til BAM tydeligvis foregår i dybdeintervallerne 0,25-0,5 mut. og 0,5-0,75 mut., hvorefter nedbrydningspotentialet falder kraftigt. At nedbrydningen er begrænset i muldlaget må betegnes som overraskende, idet den største diversitet af mikroorganismer som regel findes i overjorden. En mulig forklaring kan være, at tilgængeligheden af dichlobenil for mikroorganismerne begrænses af den kraftige sorption af dichlobenil i dette dybdeinterval (tabel 10). Dette forklarer således også, hvorfor nedbrydningen er mere begrænset i overjorden fra Staurbyskov end i overjorden fra Eskærhøj, idet der er større sorption i sedimentet fra Staurbyskov.

Nedbrydningen af dichlobenil kvantificeres ud fra dannelse af BAM, og dannelse af andre metabolitter og videre nedbrydning af BAM indgår derfor ikke (jf. afsnit 2.3). Imidlertid er der i sedimentet fra Staurbyskov 0,25-0,50 mut. omsat 88,4% dichlobenil til BAM efter en forsøgsperiode på 436 døgn, hvorfor det må konkluderes, at BAM er den væsentligste metabolit. Usikkerheden ved at udregne nedbrydningsrater alene udfra produktionen af BAM er derfor begrænset. I de tilfælde, hvor nedbrydningen har været signifikant, er hastigheden derfor kvantificeret ved 0.-og 1.-ordens halveringstider (DT₅₀) (tabel 11).

Tabel 11.
0.- og 1.-ordens halveringstider for dichlobenil med tilhørende korrelationskoefficienter. Kun nedbrydning til BAM indgår. I.M. (ikke målelig) angiver, at der er mindre end 0,5% nedbrudt i forsøgsperioden. DIC-I og DIC-II angiver hhv. inkubation 1 og 2 opsat for det samme sediment.

I de fleste tilfælde beskriver både 0.ordens- og 1.ordens-kinetik nedbrydningen af dichlobenil til BAM med gode korrelationer (tabel 11), men der er dog en tendens til, at 1. ordens kinetik giver en bedre korrelation i de inkubationer, hvor den hurtigste nedbrydning forekommer.

Der er i flere tilfælde beregnet halveringstider på mere end 30 år (10.950 døgn), og det kan derfor diskuteres, om en halveringstid med rimelighed kan kvantificeres. At der dog er tale om en minimal produktion af BAM, ses i bilag C, hvor nedbrydning af dichlobenil er udtrykt som ng BAM dannet pr. g tørt sediment. Det ses her, at det kun i de to nederste sedimenter fra Eskærhøj og Hvidovre ikke er muligt at spore en nedbrydning. Det fremgår desuden af bilag C, at BAM-produktionen starter med det samme – altså uden en lag-fase. Dette tyder på, at nedbrydningen er cometabolisk, dvs. at omdannelse af dichlobenil foregår vha. et eller flere enzymer, som normalt katalyserer andre reaktioner, og mikroorganismerne i sedimentet har ingen fordel af at omsætte stoffet (Holliger, 1992).

5.3.2 Nedbrydning af BAM

Resultater fra inkubationer med BAM er udtrykt ved ¹⁴C-koncentrationen i væskefasen versus tid (figur 12-14). I nedbrydningsforsøg, hvor der måles på koncentrationen af moderstoffet i stedet for produktionen af metabolitter, er det vanskeligt at skelne mellem sorption og nedbrydning. På figur 12-14 er derfor indtegnet den teoretiske ligevægtskoncentration i væskefasen med 95% konfidensinterval beregnet ud fra sorptionsforsøgene (tabel 10). Det skal dog nævnes, at sorptionen i de autoklaverede kontroller i nogle tilfælde er væsentlig anderledes end estimeret ud fra K_d-værdien bestemt i sorptionsforsøgene, idet autoklavering ændrer karakteren af det organiske stof.

I de fleste inkubationer med BAM er der overensstemmelse mellem de beregnede ligevægtskoncentrationer i væskefasen efter sorption og de observerede koncentrationer, og en nedbrydning af BAM kan derfor ikke detekteres (figur 12-14). Imidlertid er der i sedimenterne fra Staurbyskov og Eskærhøj 0-0,75 mut. et fald i den ¹⁴C-mærkede koncentration i væskefasen som er større end forventet ud fra sorptionsforsøgene, samtidig med at koncentrationerne i kontrollerne er konstante (figur 12-14). Dette indikerer, at BAM nedbrydes mikrobielt i den øverste meter af den umættede zone i både Staurbyskov sedimentet og Eskærhøj sedimentet. Endvidere er der fundet en indikation af, at BAM kan nedbrydes også i dybere liggende sedimenter omkring grundvandsspejlet, idet der i sedimentet fra Staurbyskov 4,96-6,18 mut. er tegn på nedbrydning, men denne tendens ses ikke for sedimenterne fra Eskærhøj og Hvidovre.

Se her!

Figur 12.
¹⁴C-koncentration versus tid i BAM-inkubationer med sediment fra Staurbyskov. Den teoretiske ligevægtskoncentration er indtegnet med 95%konfidensinterval beregnet ud fra resultater af sorptionsforsøgene (tabel 10).
   

Se her!

Figur 13.
¹⁴C-koncentration versus tid i BAM-inkubationer med sediment fra Eskærhøj. Den teoretiske ligevægtskoncentration er indtegnet med 95% konfidensinterval beregnet ud fra resultater af sorptionsforsøgene (tabel 10).
   

Se her!

Figur 14.
¹⁴C-koncentration versus tid i BAM-inkubationer med sediment fra Hvidovre. Den teoretiske ligevægtskoncentration er indtegnet med 95%konfidensinterval, beregnet ud fra resultater af sorptionsforsøgene (tabel 10).

For at afgøre hvorvidt BAM mineraliseres (sandsynligvis via mineralisering af sidekæden i 2,6-dichlorbenzoesyre) til CO₂, er der efter sidste prøvetagningsdag tilsat saltsyre til den ene af duplikaterne (BAM-II,) fra samtlige dybdeintervaller samt til udvalgte kontrol-inkubationer, og aktiviteten af den derved producerede mængde ¹⁴CO₂ er målt. Resultaterne fra de inkubationer, hvor der er målt en signifikant mængde ¹⁴CO₂ (>0,5%), er vist i tabel 12. Det ses, at der kan detekteres en signifikant nedbrydning af BAM i sedimenterne fra Staurbyskov og Eskærhøj 0-0,75 mut. og i sedimentet fra Staurbyskov 4,96-6,18 mut. Nedbrydningen er sandsynligvis mikrobiel katalyseret, idet der ikke er detekteret ¹⁴CO₂ i de undersøgte kontroller. Imidlertid kan nedbrydningen af BAM ikke kvantificeres ud fra ¹⁴CO₂-målingerne, idet inkubationerne er udluftet igennem forsøget for at sikre aerobe forhold, hvorfor ¹⁴CO₂ er afgasset. Som et groft estimat er nedbrydningen af BAM i de omtalte sedimenter derfor udregnet ud fra den relative forskel mellem den forventede koncentration i væskefasen efter sorptionsligevægt og den målte ¹⁴C-koncentration efter 436 døgn (tabel 12). Ved beregningen er brugt den nedre grænse for konfidensintervallet for ligevægtskoncentrationen efter sorption. De derved estimerede DT₅₀-værdier er i størrelsesordenen 3-16 år, idet den hurtigste nedbrydning er i muldlaget (0-0,25 mut.), hvorefter nedbrydningstiden forøges med dybden.

Tabel 12.
Den relative målte koncentration af 14CO₂ og den estimerede relative nedbrydning af BAM med tilhørende estimerede 1. ordens halveringstider.

*Nedbrydning af BAM er estimeret ud fra den relative forskel mellem den nedre grænse med 95% konfidens for ligevægtskoncentrationen i væskefasen beregnet ud fra sorptionsforsøg og den målte koncentration i væskefasen efter 436 døgn.

5.3.3 Diskussion og opsummering

Resultater fra inkubationer med dichlobenil viser, at nedbrydningen af dichlobenil til BAM primært foregår i de øverste 0,75 mut. Der sker tilsyneladende en mindre nedbrydning længere nede i den umættede zone, mens nedbrydningen under grundvandsspejlet er ubetydelig. Den aftagende nedbrydningsrate med dybden er en klar tendens, og da nedbrydningen til BAM ud fra den manglende lagfase og den ubetydelige nedbrydning i kontrollerne er vurderet at være en cometabolisk hydrolyse, peger resultaterne i retning af, at mængden af et specifikt nedbrydende enzym i sedimentet er bestemmende for nedbrydningshastigheden. Raterne er generelt højere for sediment fra Staurbyskov end for sediment fra Eskærhøj, og det samme er indholdet af organisk stof (jf. tabel 5), hvorfor sedimentet fra Staurbyskov generelt formodes at være mere mikrobielt aktivt.

BAM er som ventet vanskeligt nedbrydelig, og i de undersøgte sedimenter fra umættet og mættet zone er det stort set kun i overjorden (0-0,75 mut.), at der forekommer en nedbrydning af BAM efter en forsøgsperiode på 436 døgn. Der er dog for en lokalitet målt en begrænset nedbrydning omkring grundvandsspejlet i dybdeintervallet 4,96-6,18 mut. Der er ikke påvist nedbrydning af BAM i sedimenter udtaget under grundvandsspejlet.