| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Optimering og validering af metode til påvisning af Cryptosporidium og Giardia i drikkevand

2 Metodebeskrivelse

I det nærværende studie er en metode til påvisning af Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster blevet optimeret og valideret. Metoden er valideret via bestemmelse af genfindelsesprocenten ved tilsætning af kendte mængder oocyster og cyster i forskellige koncentrationer til vandprøverne. Til valideringen er anvendt 6 vandprøver af forskellig kvalitet. For hver vandprøve er der foretaget 10 filtreringer à 10 liter med hver af de følgende cyste/oocyste koncentrationer: 100, 1000 og 10.000. Vandprøverne er blevet filtreret, opkoncentreret vha. centrifugering og immunomagnetisk separation (IMS), og sluttelig farvet og aflæst vha. immunofluorescens.

2.1 Filtrering og opkoncentrering af vandprøver

Formål

Formålet med dette trin er at filtrere vandprøver (10 l) til undersøgelse for Cryptosporidium og Giardia. Opkoncentrering af filtratet sker vha. centrifugering, således at diagnostik via immunomagnetisk separation (IMS) og immunofluorescens (IF) efterfølgende kan foretages.

Materialer

Membranfilterholder, rustfrit stål, d: 142 mm (Millipore, DK)
Isopore filtre, 2 µm, 142 mm (Millipore, DK)
5 l konisk sugekolbe
Silikonegummislange, d: 6 mm, godstykkelse 2 mm (Bie & Berntsen, DK)
Sterile engangspincetter (Maersk Medical A/S, DK)
Krystallisationsskåle, d: 19 cm (Duran, Schott, Tyskland)
LDPE plastik poser (100 x 200 x 0,07 mm) (Microgen, UK)
Pulsifier (Microgen, UK)
Spidsbundede centrifugerør med skruelåg, 50 ml (Corning, USA)
Centrifuge (Hettich Rotanta, Tyskland)

Positiv kontrol: 5 l ionbyttet (eller Milli-Q) vand tilsat 500 Cryptosporidium parvum oocyster ('Copenhagen calf laboratory isolate', CPB-0) samt 500 Giardia cyster (Giardia lamblia H3 isolat i 5% formalin/PBS, Waterborne Inc. New Orleans, USA)

Negativ kontrol: 5 l ionbyttet vand.

(Til validering af metoden er den positive kontrol blevet tilsat samme antal oocyster/cyster som de egentlige vandprøver.)

Filtrering

Generelt: Ved filtrering bruges handsker, og der arbejdes så sterilt som muligt. Filtre samt indvendig side af filterholderen berøres ikke.

1. Filterholderen vaskes ved 60°C og autoklaveres.
2. Et isopore membran filter (2,0 mm) monteres vha. en steril pincet, således at den glatte side vender opad. Undgå at røre ved indersiden af filterholderen. (se yderligere 'instruks om brug og vedligeholdelse af filterholder, Sartorius SM 16275') (Bilag 2).
3. Filterholderen monteres på en 5 l konisk sugekolbe tilsluttet vakuum.
4. Vandprøven rystes. En steril silikonegummislange monteres på filterholderen og føres helt til bunds i vandprøven. Dette skal ske sterilt uden berøring af den del af slangen, som kommer i direkte kontakt med vandet.
5. Åben for vakuumhanen (20-40 mbar).
6. Når halvdelen af vandprøven er filtreret (ca. 5 l) tømmes sugekolben, idet filterholderen afmonteres og stilles på en 'trefod'. Det filtrerede vand hældes direkte i vasken. Filterholderen remonteres og resten af vandprøven filtreres.
7. Silikoneslangen afmonteres og smides til vask. Skruerne på filterholderen løsnes forsigtigt, og den øverste del af filterholderen lægges til side på 'trefoden'. Bevar vakuumet indtil den øverste del af filterholderen er fjernet. Dette forhindrer, at der opsamles vand over filtret.
8. Isopore membran filtret, hvorpå eventuelle Cryptosporidium/Giardia vil være opfanget, overføres forsigtigt med en steril pincet til en krystallisationsskål, hvor der forinden er ophældt 100 ml ionbyttet vand. Filtret skal være dækket med vand og må ikke ligge foldet.
9. Filtret skylles ved at skvulpe vandet forsigtigt rundt i skålen i 2 minutter.
10. Vandet hældes forsigtigt over i 2 50 ml centrifugerør.
11. Filtret rives i 8-10 stykker vha. 2 sterile pincetter og overføres til en LDPE pose.
12. Den øverste del af filterholderen skylles med 100 ml ionbyttet vand, som opsamles i krystallisationsskålen. Vandet overføres fra skålen til LDPE posen.
13. Posen indeholdende 100 ml vand og filterstykker indsættes i 'pulsifieren' og rystes i 2 minutter, hvorefter filtret fjernes vha. en steril pincet.
14. Vandet fordeles på yderligere 2 50 ml centrifugerør, så der i alt er 4 centrifugerør pr. prøve. Centrifugerørene mærkes med prøvens nummer og stilles på køl (5°C) indtil centrifugering.
15. Over- og underdelen af filterholderen skylles manuelt med hver 500 ml ionbyttet vand.
16. Filterholderen uden filter påsættes den tømte sugekolbe. En ny silikoneslange monteres og overføres sterilt til en glasflaske med ca. 5 l ionbyttet vand, som suges gennem filterholderen.
17. Filtrering af en ny vandprøve gennemføres ved gentagelse af trin 2-16.

NB. Efter hver 10. prøve medtages en negativ og en positiv kontrol. Efter en positiv kontrol skal filterholderen sendes til vask og autoklavering.

Opkoncentrering ved centrifugering

1. Prøverne centrifugeres med låg på i 15 minutter ved 1900 x G, ingen bremse.
2. Supernatanten afsuges vha. en 5 ml steril målepipette tilsluttet vakuum. Der suges fra toppen ned til 10 ml. Indholdet af de 4 rør samles i ét rør. De 4 rør skylles efter med ca. 2,5 ml ionbyttet vand, så den samlede væskemængde i det ene rør bliver 50 ml.
3. Prøverne centrifugeres med låg på i 15 minutter ved 1900 x G, ingen bremse.
4. Supernatanten afsuges til 10 ml. Prøven stilles på køl ved 5°C indtil yderligere behandling. Prøven bør ikke henstå i mere end 2 uger.

2.2 Oprensning af Giardia cyster og Cryptosporidium oocyster fra vand vha. immunomagnetisk separation

Formål

Oprensning af Giardia cyster hhv. Cryptosporidium oocyster med henblik på efterfølgende detektion vha. immunofluorescens. De oprensede cyster/oocyster er relativt rene og derfor tillige velegnede til DNA ekstraktion oganalyse.

Materialer

Dynabeads GC-Combo kit (Dynal A/S, Norge)
Dynal sample mixer (Dynal A/S, Norge)
Magnetic particle concentrator (Dynal MPC-1) (Dynal A/S, Norge)
Magnetic particle concentrator for microcentrifuge tubes (Dynal MPC-S) (Dynal A/S, Norge)
Dynal L10 tubes (Dynal A/S, Norge)
Dynal spot-On, objektglas (Dynal A/S, Norge)
Vortex mixer
Eppendorff rør (1,5 ml)
Pasteur pipetter
Pipette spidser (10-1000 µl)
Ionbyttet vand
HCl opløsning 0,1 M (saltsyre)

Forberedelse af reagenser

Alle materialer inkl. vandprøven skal have stuetemperatur (15-25°C)

Til hver prøve anvendes:

1 ml 1x SL^TM-Buffer A
1 ml 10x SL^TM-Buffer A
1 ml 10x SL^TM-Buffer B

	Forbered 1 ml 1x SLTM-Buffer A ud fra 10x SLTM-Buffer A. (10x SLTM-Buffer A opløsningen skal være fri for krystaller. Disse fjernes lettest ved at holde bufferen i bevægelse, indtil krystallerne er opløst). 100 ml 10x SLTM-Buffer A fortyndes til 1 ml ved tilsætning af ionbyttet vand. Der bruges 1 ml 1x SLTM-Buffer A for hver 10 ml prøve, der opkoncentreres med Dynal IMS.
	Fortyndingen af 1 ml 1x SLTM-Buffer A opbevares i et mærket Eppendorff rør til brug senere i processen.

NB! Hvis bundfaldet i den enkelte prøve overstiger 0,5 ml svarende til ca. 5%, bør man ifølge Dynal's forskrifter fordele prøven i flere rør med hver maksimalt 0,5 ml bundfald og udføre IMS for samtlige prøver.

Binding af Cryptosporidium og Giardia til Dynabeads

Dissociation af Dynabeads - cyste/-oocyste kompleks

Skulle den positive eller negative kontrol afvige fra det forventede, bør man kassere de pågældende prøver og starte forfra med filtreringen.

Efter lufttørring bør man kun farve de prøver, som man forventer at kunne aflæse samme dag. U-farvede prøver kan opbevares på køl i op til et par dage. Ved længere opbevaring vil prøverne kunne miste evnen til at farves ordentligt.

2.3 Detektion af Cryptosporidium og Giardia vha. immunofluorescens

Formål

Detektion af Cryptosporidium / Giardia i oocyste/cyste suspensioner

Materialer

Merifluor Cryptosporidium / Giardia kit (Meridian Diagnostics, Inc.; Italien)
Metanol (100%)
Ionbyttet vand
Dækglas (22 x 50 mm)
Pipette spidser (5-200 µl)
Fugtkammer (En stor petriskål med låg, hvori lidt fugtigt papir lægges i bunden. Ovenpå papiret placeres 2 træpinde som støtte for objektglassene).
Fluorescens mikroskop (excitation 490 nm / emission 520 nm) med 25x og 40x objektiv (250 og 400x forstørrelse).

Farvning og aflæsning

1. Prøven, som er overført til et Dynal Spot-On objektglas, indtørres fuldstændigt og fikseres ved tilsætning af 50 µl metanol. Objektglasset henstår ved stuetemperatur, indtil metanolen er fordampet.
2. En dråbe detektionsreagens samt en dråbe kontrastfarve tilsættes hver brønd. Det er vigtigt, at hele præparatet er dækket.
3. Prøven inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (fugtkammer + mørke).
4. Herefter vaskes prøven med 1 x vaskebuffer eller PBS pH 7, idet reagenserne forsigtigt afsuges med pipette, hvorefter brøndene skylles med 50 ml vaskebuffer. Gentages 3-5 gange. Undgå at ridse præparatets overflade.
5. Overflødig vaskebuffer fjernes ved forsigtigt at banke siden af objektglasset mod en serviet. Undgå at præparatet udtørrer fuldstændigt.
6. Hver brønd tilsættes 1-2 dråber Mounting Medium, og dækglas lægges over uden at trykke.
7. Der mikroskoperes ved 250 x forstørrelse. Positive fund eftervises ved 400 x forstørrelse. Cryptosporidium parvum fremtræder som 4,5 x 5 mm runde til let ovale, grønt fluorescerende organismer i nogle tilfælde med synlig 'sutur linie'. Giardia cyster er runde til ovale, 8-12 mm og grønt fluorescerende (Figur 3).

Figur 3.
Fluorescens-mikroskopisk billede af Cryptosporidium oocyster (øverst til venstre) og Giardia cyster (nederst til højre). (http://www.dpd.cdc.gov).

Tabel 1.
Eksempler på forskellige arter af Cryptosporidium og Giardia, som kan findes i bl.a. vand. (Bemærk: Sikker artsdifferentiering bør kun foretages på baggrund af morfologiske undersøgelser (størrelse og form) kombineret med DNA analyse).

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |