|
Optimering og validering af metode til påvisning af Cryptosporidium og Giardia i drikkevand 4 MetodevalideringTil validering af metoden blev anvendt 6 vandtyper af forskellig kvalitet: Tre rentvandsprøver fra hhv. Kingosvej, Mørkskov og Regnemark vandværk, samt 3 råvandsprøver fra Kingosvej og Mørkskov vandværk tillige med Ejby råvandsboring. Parametre for vandkvaliteten er angivet i Tabel 2, og en sammenfatning af vandkvaliteten er angivet nedenfor. Tabel 2. Ejby råvand: Vand med højt indhold af jern, kalk og ammonium. Desuden et middel niveau af metan samt NVOC. Regnemark rent vand: Vand med lave koncentrationer af jern, svovlbrinte og metan. Indholdet af NVOC ligger på grænseværdien på 4 mg/l. Ammonium indholdet er højt. Kingosvej råvand: Vandet med et højt indhold af metan og svovlbrinte samt noget (middel) ammonium. Kingosvej rent vand: Vand med et relativt højt indhold af organisk stof. Vandet opfylder kvalitetskravene til rent vand, dvs. metan og svovlbrinte fjernes. Ammonium er under grænseværdien. Mørkskov råvand: Vandet med et højt indhold af jern, samt noget ammonium (middel), svovlbrinte (middel) og metan (middel). Desuden relativt hårdt vand med et højt bikarbonatindhold. Mørkskov rent vand: Jern, metan og svovlbrinte formodes at være fjernet, således at grænseværdierne er overholdt (meget lave niveauer). Parasitmateriale Cryptosporidium parvum oocyster ('Copenhagen calf laboratory isolate', CPB-0) samt Giardia lamblia cyster (H3 isolat i 5% formalin/PBS, Waterborne Inc. New Orleans, USA) blev anvendt til podning af prøverne. For hver vandprøve blev der foretaget 10 filtreringer à 10 liter hver med følgende cyste/oocyste podningsdoser: 100, 1000 og 10.000. I alt blev der foretaget 30 filtreringer for hver vandtype (se tabel 3). Tabel 3.
Filtrering, oprensning og detektion blev gennemført ifølge metodebeskrivelsen. Prøverne blev farvet og aflæst senest 2 dage efter IMS-oprensning. Til podning af vandprøverne blev oocyste/cyste brugs-opløsninger forberedt ud fra en stamopløsning med en kendt oocyste/cyste koncentration bestemt vha. hæmocytometer. Hver brugs-opløsning indeholdt det pågældende antal oocyster/cyster pr. ml som skulle tilsættes vandprøven. For at kontrollere den tilsatte dosis af hhv. Giardia cyster og Cryptosporidium oocyster, blev for hver ny podning parallelt udtaget 3 x 100 µl af brugs-opløsningerne på nogle Dynal spot-On objektglas. Disse stod til tørring, hvorefter de blev farvet ifølge forskriften. Podningsdosen blev udregnet fra gennemsnittet af de tre tællinger og resultaterne er anført i tabel 5. Som led i valideringen blev det undersøgt, hvorvidt der var interaktion mellem Giardia og Cryptosporidium, idet eksempelvis høj koncentration af den ene art kunne tænkes at påvirke genfindelsen af den anden art. Disse forsøg blev udført i postevand, der blev tilsat hhv. 10.000 af den ene parasit og 100 af den anden og vice versa. For hver kombination blev der lavet 5 filtreringer. Desuden blev resultaterne af de positive kontroller, fra forsøg tilsat 10.000 af hver parasit, sammenlignet med interaktionsforsøgene, for at vurdere hvorvidt en samtidig høj koncentration af begge parasitter havde en negativ effekt på genfindelsesprocenten. Forsøg med råvand viste, at der ikke var den forventede genfindelse af Cryptosporidium oocyster. For at verificere at oocysterne blev fanget i filtret, blev der efter nogle enkelte filtreringer og inden IMS udtaget 50 ml af prøven på et objektglas. Prøven blev farvet efter Merifluors forskrifter og aflæst i fluorescens mikroskop. I alle tilfælde kunne der påvises oocyster i prøven efter filtrering.
|
||||||||||||||||||||||||||||||