|
Optimering og validering af metode til påvisning af Cryptosporidium og Giardia i drikkevand 6 DiskussionFor både råvand og rent vand gælder det, at genfindelsen af Giardia er større end genfindelsen for Cryptosporidium. Dette kan skyldes, at Giardia cysterne er større og derfor lettere bliver opfanget af filtret. Desuden er det i henhold til Dynal Biotech vist, at bindingen mellem Giardia og Dynabeads anti-Giardia er stærkere end bindingen mellem Cryptosporidium og Dynabeads anti-Cryptosporidium. Dette kan være årsagen til, at der i råvand genfindes mange Giardia cyster men ingen eller kun få Cryptosporidium oocyster. For hver gang prøverne blev podet blev koncentrationen af stamopløsningen kontrolleret. Tallene for Giardia koncentrationerne lå ofte under det forventede på hhv. 100, 1000 og 10.000 pr. ml stamopløsning. Til trods for dette var genfindelses resultaterne for de testede vandprøver omkring det forventede niveau. Der er muligvis sket en udvaskning af nogle Giardia cyster under farvning, omend dette ikke synes at være tilfældet ved farvning af de egentlige prøver. Det er et kendt problem, at Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster har en tendens til at klumpe sammen og bundfælde, hvilket besværliggør en nøjagtig podning af prøverne. Generelt må det antages, at den store standardafvigelse i protozo-genfindelsen ikke mindst i prøver tilsat få oocyster/cyster er forårsaget af såvel en variation i mængden af tilsatte protozoer som en metode relateret (filtrering, IMS, fluorescens) variation. Samtidig kan de påviste forskelle i genfindelsen i forhold til koncentrationen, formentlig i nogen grad tillægges usikkerhed forbindelse med podning af prøverne. Råvandets kemiske og biologiske sammensætning udskiller sig på de fleste punkter ikke meget fra det rene vand. Der er mere jern i råvandstyperne end i nogen af rentvandstyperne, især i Ejby råvand (3,7 mg/l) men også i Kingosvej råvand (0,05-0,09 mg/l), som i øvrigt indeholder mindst jern af de tre råvandstyper. For alle råvandstyper er der også betydeligt mere ammonium end i det rene vand. Derudover ser det ud til, at der i råvandet er mere bikarbonat og svovlilte end i det rene vand, men for disse parametre foreligger ikke værdier for alle vandtyperne. I modsætning til Giardia var der stort set ingen genfindelse af Cryptosporidium i råvand. Cryptosporidierne var påvist i prøven efter filtrering, så derfor må det konkluderes at være IMS-opkoncentreringen, der ikke fungerede i råvand. Dette kunne evt. skyldes mængden af jern i råvandet eller den forholdsvis store mængde bundfald, selvom denne dog ikke overskrider Dynals forskrifter. Bindingen mellem Cryptosporidium oocysterne og Dynabeads anti-Cryptosporidium er ikke kraftig, og det kan tænkes, at stoffer i bundfaldet svækker bindingen yderligere. Immunofluorescens farvningen af Giardia var ikke optimal i råvand. Op til 50% af cysterne i Ejby råvand blev ikke farvet, mens en stor del af resten kun blev farvet delvist. I mange tilfælde var det kun muligt at identificere Giardia, fordi det på forhånd var kendt, at elementer af pågældende størrelse og form i disse prøver kun kunne være denne parasit. I vandprøver med ukendt forekomst er denne dårlige farvning ikke acceptabel, da kun grønt fluorescerende / specifikt mærkede organismer bør registreres. For de øvrige råvandstyper var farvningen bedre men stadig ikke på samme niveau som i rent vand. På baggrund af nærværende resultater må det konkluderes, at metoden ikke er anvendelig til påvisning af Cryptosporidium og Giardia i råvand, da den vil kunne føre til falske negative resultater. Cirka halvdelen af rentvandsprøverne fra Mørkskov vandværk blev ikke farvet og aflæst før 5-6 dage efter IMS, hvilket tilsyneladende havde mindsket deres evne til at fluorescere. Alle prøverne var dog mulige at aflæse. I rent vand var der for 3 vandtyper (inkl. interaktionsforsøget, hvor der blev brugt postevand) en gennemsnitlig genfindelse på ca. 35 % for Cryptosporidium og ca. 50% for Giardia. For én rentvandstype (Kingosvej) var genfindelsen for Giardia dog noget lavere i prøver med hhv. 1000 og 10.000 oocyster/cyster. På baggrund af kontrolforsøget, hvor resultaterne viste en cirka dobbelt så stor genfindelse i forhold til den positive kontrol, må det antages, at den lave genfindelse af Giardia skyldes en fejl i tilsætning af Giardia cyster til prøverne. Det er, som nævnt, kendt at (oo)cyster tenderer til at være ujævnt fordelt i en væske og problemer med dette har ført til, at man f.eks. for oocyster anbefaler anvendelse af flowcytometer til tælling og dispensering af oocysterne ved spiking af vandprøver (f.eks. Sturbaum et al., 2002). Herved kan opnås et helt præcist kendskab til den tilsatte mængde oocyster og minimering af podningsdosering som fejlkilde. Resultaterne af denne undersøgelse afviger ikke fra, hvad der tidligere er beskrevet. Således blev i engelske sammenlignende studier af oocyste- hhv. cyste-genfindelsen efter filtrering af spikede (ca. 100 (oo)cyster pr 10 l) vandprøver genfundet 10-41% oocyster hhv. 22-52% cyster ved brug af 1,2 mm pore membranfilter og ubetydeligt færre ved brug af 3,0 µm pore membranfilter (Shepherd & Wyn-Jones, 1996). Tilsvarende resultater er opnået ved Taiwanske analyser af såvel råvand som renset vand for de 2 protozoer, nemlig med en genfindelse på 16-17% oocyster hhv. 38-40% cyster. Det blev tillige fundet, at detektionsgrænsen for organismerne i råvand med høj turbiditet var betydeligt højere end i renset vand (altså en lavere sensitivitet) (Hsu et al., 2001). I de omtalte undersøgelser blev ikke anvendt IMS-oprensning, men udelukkende filtrering og efterfølgende IFAT. Ved studier af genfindelsen af (oo)cyster fra vand af varierende turbiditet under anvendelse af IMS er beskrevet genfindelser af oocyster hhv. cyster på 56-83% hhv. 61-89% (McCuin et al., 2001). Disse genfindelser er højere end hvad vi har fundet - men undersøgelserne er foretaget på prøver efter justerende fortyndinger til frembringelse af analyserbart materiale. Sådanne justeringer synes ikke relevante til brug ved rutinemæssige undersøgelser. Der er ikke bestemt en nedre grænse for, hvad metoden kan detektere, men baseret på den fundne genfindelse for Cryptosporidium oocyster på minimum 25 % forventes det, at metoden kan detektere 2-3 oocyster i prøver med kun 10 oocyster. For Giardia kan metoden detektere 4-6 cyster ud af prøver med kun 10 cyster. Der er ved metodevalideringen ikke påvist en øvre begrænsning i antallet af oocyster/cyster, der kan detekteres, men denne er først og fremmest afhængig af IMS-processen. Da formålet med analysen snarere er vurdering af parasitternes forekomst end kvantitering af store antal, er yderligere afgrænsning ikke relevant. Fordelene ved den her beskrevne metode er, at det kun er nødvendigt at filtrere forholdsvis små mængder vand, i forhold til andre metoder hvor der skal filtreres op til 1000 l vand (Baker et al., 1998). Den lille vandmængde betyder, at selve filtreringen kan foregå på et laboratorium i stedet for ude på selve vandværket. Metoden er nem at bruge og kræver ikke meget oplæring. Det meste af det nødvendige udstyr er standard laboratorium udstyr. Genfindelsen ved brug af denne metode er relativt stabil og samtidig relativt høj i forhold til ved brug af andre metoder, hvor genfindelsen kan være helt ned til 3% (Hansen & Stenström, 1998). Metodens største ulempe er, at den er forholdsvis tidskrævende.
|