Bioremediering ved hjælp af planter og gensplejsede bakterier
3 Oversigt over resultaterne
A. Aktivitet og genekspression i rodzonen:
Måling af den metabolske aktivitet af Pseudomonas fluorescens F113rifpcb ved hjælp af markerede modelbakterier viste, at bakteriestammen kun vokser i den umiddelbare nærhed af rodspidserne. Det betyder, at den metabolske aktivitet af de celler af Pseudomonas fluorescens F113rifpcb, som ikke sidder på en rodspids, er lav. Dette er en overraskelse, idet man havde forventet, at alle bakterier i rodzonen har høj aktivitet. Men det i sig selv vil ikke betyde, at bakteriernes nedbrydningsaktivitet også er lav. (Se i den forbindelse resultaterne under punkt D).
Det viste sig, som forventet, at stammen F113rifpcb kun har en lav ekspression af bph genkompleks, d.v.s. dennes nedbrydningsaktivitet er på lavt niveau. Det skyldes, at stammen var verdens første forsøg på at gensplejse denne type bakteriestammer, og der derfor ikke blev brugt de allernyeste metoder for at forøge genekspressionen. Man var altså dengang tilfreds med gensplejsningen, hvis stammen overhovedet viste aktivitet, hvilket den gjorde. Forøget ekspression af bph genkompleks blev opnået med konstruktion af den nye stamme Pseudomonas fluorescens F113L:1180, hvori en genregulator fra Sinorhizobium meliloti anvendes. Men som en stor overraskelse er regulatoren i Pseudomonas fluorescens F113 altid aktiv. Det var forventet, at den sætter genekspression under kontrol af rodeksudater (fra lucerne), dvs. den nye Pseudomonas fluorescens F113L::1180 forventedes kun at være aktiv i rodzonen af lucerne. Faktisk er den dog aktiv i alle nicher, og den er betydelig mere aktiv end stammen F113rifpcb.
Stammen Pseudomonas fluorescens F113 L::1180, der er splejset med den alternative genregulator for at styrke bph genekspression, gennemførte i renkultur omdannelsen af 4-PCB til 4-chlorbenzoesyre betydeligt hurtigere end stammen Pseudomonas fluorescens F113rifpcb. Den sidstnævntes bph genekspression er styret af den naturlige genregulator af bph genkomplekset.
Måling af nedbrydnings-aktivitetet af Pseudomonas fluorescens F113rifpcb ved hjælp af markerede modelbakterier viste, at bakteriestammen omdanner 3-PCB til 3-chlorbenzoesyre i rodzonen af lucerne. Cirka 1% af bakteriecellerne var målbare aktive. Resultatet var overraskende lavt, men det må tages i betragtning, at målemetoden underestimerer antallet af aktive bakterier. Det blev desuden påvist, at nedbrydningen ikke kun skete i særlige rodafsnit (f.eks. rodspidserne), men lige kraftigt i alle afsnit af rodoverfladen. Dette resultat viser, i forbindelse med de andre resultater beskrevet i dette kapitel, at nedbrydningsaktiviteten i den gensplejsede bakteriestamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb ikke er afhængig af niveauet af bakteriecellernes almindelige celle-metabolisme. Med andre ord, bakterien kan nedbryde 3-PCB selvom den ikke er i gang med at vokse.
B. Begrænset overlevelse af de podede bakterier:
Selvom der blev udviklet stammer af Pseudomonas fluorescens F113 med begrænset overlevelse, afsluttede projektet ikke konstruktionen af en bakteriestamme med overlevelse under kontrol af rodeksudater.
C. Podningsmetoder:
Metoder for effektiv podning af planterødder til anvendelse i fytoremediering blev udviklet og er klar til brug. Metoderne bygger på, at bakterierne dyrkes i renkulturer og blandes med et fugtigt bæremateriale. Derefter bruges bærematerialet som pilleringsmasse til plantefrø. Enkelte frø coates med pilleringsmassen og tørres straks derefter. Pillernes fugtighed justeres så de er fugtige nok til at bakterierne overlever, men tørre nok til at frø ikke spirer. Detaljerne af proceduren, især sammensætningen er bærematerialet, er hemmeligholdte opskrifter af en af projektets partnere.
Pseudomonas fluorescens F113 podet på lucerne-frø eller pilestiklinger koloniserede hele overfladen af roden, som enkelte celler eller mikrokolonier. Dette blev påvist med lucerne ved hjælp af mikroskopi, som vist i figur 2. Bakterierne, som på billederne er lysegrønne, blev oftest set i linier svarende til overgangene mellem rod epidermis celler (2a) og ved bunden af rod hår (2c) og siderødder (2b). Der blev også fundet bakteriekolonier fordelt på overfladen af siderødderne og rod hår (2b, 2c, 2d, 2e). Det vigigste var, at bakteriecellerne også fandtes i mucigel på rodspidserne (2f). Tilsvarende mikroskopiske observationer blev lavet med pilerødder (billederne er ikke vist).
Antallet af cellerne af stamme F113 blev kvantificeret i forsøg med PCB-forurenet jord (figur 1). I såvel jord med pil, som i plantefri jord, var der et betydeligt fald i bakterietallet i tiden efter inokulering, men med pil var aftagelsen omkring en faktor 10 langsommere end uden pil.
Det konkluderes, at Pseudomonas fluorescens F113 kan podes på lucerne og pil for at etablere bakteriestammen i PCB-forurenet jord.
Figur 1:
Overlevelse af en stamme af F113 i rhizosfæren af pil og i jord uden pil. Romber:
Bakterietal i rhizosfære-jord. Kvadrater: Jord uden planter. Vertikale linier viser
standardafvigelser af 3 replikater.
Figur 2:
Stamme Pseudomonas fluorescens F113 i rhizosfæren af lucerne.
Undersøgt ved hjælp af et confocal laser scanning mikrokop. De selvlysende grønne områder er enkelte bakterieceller, der ligger meget tæt ved siden af hinanden.
D. Anvendelse til forskellige forureningsstoffer.
Udvidelse af konceptet fra nedbrydning af PCB’er til nedbrydning af andre forureningsstoffer er ikke afsluttet.
Det blev påvist at den gensplejsede stamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb kan omdanne mono- og di-klorerede PCB’er til CO2. Omdannelsen sker hurtigst med 4-PCB, og derefter med 2-PCB og 3-PCB (figur 3).
Figur 3 (A):
Dannelse af CO2 ved kulturer af den gensplejsede stamme Pseudomonas
fluorescens F113pcblacZ i minimal medie med forskellige modelstoffer som kulstofkilde. (B)
er en forstørrelse af (A).
I laboratorie-eksperimenter med 4-PCB forurenet jord, pil og bakterier blev forureningen hurtigt fjernet (figur 4). Der kunne ikke ses en effekt af den podede stamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb. Dette skyldes formentlig en hurtig optagelse i planten. Dette kan forklares ved hjælp af en ny matematisk model, som forudsiger, at organiske stoffer med en logKow under 5 optages i planter. Højere klorerede PCBer har en betydelig højere logKow og vil sandsynligvis ikke optages i planter, men effekten af Pseudomonas fluorescens F113rifpcb ved disse forbindelser er ikke undersøgt endnu.
Figur 4:
Den resterende 4-PCB in jord-plante systemer. ? autoklaveret jord, ? Pseudomonas
fluorescens F113rifpcb og ingen planter, ? jord alene, ? autoklaveret jord + pil, ?
Pseudomonas fluorescens F113rifpcb +pil, ? kun pil, ¦ Pseudomonas fluorescens F113riflacZ
+pil. Vertikale linier viser standardafvigelser af 3 replikater.
I bakterier, der indeholder bph genkomplexet, omdannes PCB’er via chlorbenzoater. Det er endvidere bekendt fra litteraturen, at chlorbenzoaterne frigives af bakteriecellerne. Det blev i projektet bekræftet, at stammen F113rifpcb danner og frigiver chlorbenzoater som forventet.
Det blev desuden påvist, at mono-, di- og trichlorbenzoater optages hurtigt i pileplanter (figur 5). Idet TSCF er næsten konstant med tiden, er optagelsen primært afhængig af vandforbruget, som tolkes som bevis for hurtig (passiv) optagelse af chlorbenzoat. Det betyder, at chlorbenzoater, der dannes under nedbrydning af PCB’er ved gensplejsede stammer af Pseudomonas fluorescens F113 i rodzonen af planter, vil fjernes fra jordvæsken. De producerede chlorbenzoater bliver dermed ikke til et miljøproblem.
Desuden antyder de seneste resultater, at Pseudomonas fluorescens F113 selv nedbryder chlorbenzoater. Dette forløbige resultat er en overraskelse og bliver undersøgt videre.
Figur 5:
Skæbne af 4-chlorbenzoat (4-CBA) i hydroponiske systemer med pil. TSCF (transpiration
stream concentration factor) er beregnet på basis af de målte værdier for optagelse af
chlorbenzoat (A) og den sideløbende vandforbrug (transpiration) af planterne (C).
Chlorbenzoat optages ikke i døde planter (D), idet disse ikke forbruger vand. Som kontrol
anvendes en opstilling uden planter (E).
E. Detektionsmetoder.
Udvikling af detektionsmetoder for specifikt at overvåge de gensplejsede bakterier i forbindelse med udsættelses-forsøg er kommet til et punkt, hvor metoderne er klar til brug. Genafsnit på begge sider af bph genkompleksen i den genmodificerede stamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb blev sekventeret og dernæst blev der udviklet en PCR (polymerase kædereaktion)-baseret metode for påvisning og kvantificering af bakteriestammen i jord. Tilsvarende blev der udviklet en metode for stammen Pseudomonas fluorescens F113lacZY, som er baseret på en unik sekvens i overgangen mellem det indførte genkomplex og kromosomet af vildtypen.
F. Sikkerhedsstudie og udsætningsansøgning:
Genmodificeret Pseudomonas fluorescens F113 var i stand til at overleve på døde rødder og at re-etablere sig på rødderne af nye planter, der efter tre ugers ventetid blev plantet i den samme jord. Det betyder at fjernelse af vegetation ikke fuldstændigt vil fjerne bakteriestammen i tilfælde, at man ønsker at fjerne den fra jorden. Det betyder dog også, at bakteriestammen kan anvendes effektivt, idet den efter podning overlever godt i jord. Før i tiden har der været vanskeligheder med andre laboratoriestammer, som ikke overlevede tilstrækkeligt efter podning i forurenet jord.
I forsøg med tilsætning af genmodificeret Pseudomonas fluorescens F113 til henholdsvis forurenet jord eller pilestiklinger (plantet i forurenet jord), blev der med pil vedligeholdt mere end 10 gange så mange celler af bakteriestammen per jordmasse end uden pil (figur 2). Det bekræfter, at anvendelse af vegetation er en væsentlig del af teknologien for at etablere og vedligeholde et højt antal af disse bakterier i jord. Samtidig betyder det også, at fjernelse af vegetation nedsætter antallet af bakterierne med mere end en faktor 10 indenfor få uger.
I såvel jord med som uden planter, etablerede genmodificeret Pseudomonas fluorescens F113 sig med et vis bakterietal per jordmasse. Antallet var efter nogle måneder relativ stabilt og blev kun langsomt mindre. Det er aldrig sket, at genmodificerede Pseudomonas fluorescens F113 stammer ville vokse usædvanligt i jord, og på intet tidspunkt overstiger bakterietallet det niveau, der er set for andre jordbakterier.
Rodkolonisering og bakterieantal per jordmasse var de samme med og uden PCB’er, med såvel stamme F113 som stamme F113rifpcb. Det viser, at indsplejsning af bph-generne ikke har indflydelse på, hvordan Pseudomonas fluorescens F113 overlever i miljøet.
Et økologisk felt-studie med udsættelse af de genmodificerede stammer Pseudomonas fluorescens F113lacZY og Pseudomonas fluorescens F113rifpcb er planlagt og forberedt. Stammernes økologiske karakterisering er afsluttet og resultaterne er blevet fremlagt i en ansøgning om et udsættelses-forsøg. Ansøgningen er under behandling i Skov- og Naturstyrelsen. Miljøministerens afgørelse afventes.