Ferskvandsinvertebraters bevægelsesadfærd som biomarkør for pesticideksponering og effekt2 Metoder2.1 Forsøgsdyr: Gammarus pulex og Asellus aquaticus2.2 Forsøgsbetingelser 2.3 Pesticidvalg 2.3.1 Cypermethrin 2.3.2 Esfenvalerat 2.3.3 Dimethoat 2.3.4 Azoxystrobin 2.4 Videosporing 2.4.1 Videosporingssystemet (EthoVision Pro) 2.4.2 Adfærdsparametre 2.4.3 Metodeudvikling og baggrundsadfærd 2.4.4 Databehandling 2.5 Adfærdstoksikologisk e forsøg 2.5.1 Akut adfærdstoksicitet af udvalgte pesticider 2.5.2 Relativ følsomhed af juvenile Gammarus pulex 2.5.3 Restituering efter esfenvalerat-eksponering 2.5.4 Kombinationseksponering 2.6 Mortalitetsstudier 2.7 Pesticidkvantificering 2.7.1 Metodebeskrivelse 2.7.2 Cypermethrin 2.7.3 Esfenvalerat 2.7.4 Dimethoat 2.7.5 Azoxystrobin 2.7.6 Metodevalidering 2.7.7 Nominelle koncentrationer 2.8 Statistik 2.1 Forsøgsdyr: Gammarus pulex og Asellus aquaticusFerskvandstangloppen Gammarus pulex og vandbænkebideren Asellus aquaticus blev valgt som forsøgsdyr, da de begge har følgende karakteristika: De er almindeligt forekommende i danske ferskvandssystemer, dyrenes biologi er velbeskrevet i litteraturen, og de er lette at holde i laboratoriet. Såvel G. pulex som A. aquaticus spiller en central rolle i forbindelse med den biologiske bedømmelse af vandløbskvalitet v.hj.a. Dansk Vandløbsfaunaindeks (Miljøstyrelsen 1998). Såvel forekomst som antal af begge arter er afgørende i forbindelse med fastsættelse af nøglegruppe. Ved fastsættelse af den endelige faunaklasse v.hj.a. diversitetsgrupper indgår G. pulex som positiv og A. aquaticus som negativ diversitetsgruppe. Denne kategorisering er bl.a. baseret på arternes forskellige tolerance over for organisk forurening, der kan medføre forøgelse af ammoniakkoncentration og reduktion i koncentrationen af opløst ilt (hypoxi). Maltby (1995) fandt, at A. aquaticus var fem gange mere tolerant over for hypoxi, og to gange mere tolerant over for uioniseret ammoniak, end G. pulex. For begge arter blev det endvidere observeret, at juvenile var mere tolerante end voksne individer både med hensyn til hypoxi og ammoniak. A. aquaticus er endvidere mere tolerant over for lave pH-værdier end G. pulex (Hargeby 1990; Naylor et al. 1990). Baseret på korrelationer mellem forekomsten af de to arter og en række miljøfaktorer foreslog Whitehurst (1991), at forholdet mellem antallet af G. pulex og A. aquaticus kunne anvendes til en simpel biologisk monitering af vandkvalitet i vandløb udsat for organisk forurening. G. pulex og A. aquaticus er begge vigtige detritivore, og G. pulex er fundet i tætheder op til 10.000 individer pr. kvadratmeter (Welton 1979; Andersen et al. 1993). Begge arters reproduktion, vækst, og populationsdynamik er velundersøgt (Willoughby & Sutcliffe 1976; Marcus et al. 1978; Welton & Clarke 1980; Sutcliffe & Carrick 1981; Sutcliffe et al. 1981; Gee 1988; Sutcliffe 1992; Graça et al. 1993a; Sutcliffe 1993a, b; Graça et al. 1994a). Welton & Clarke (1980) estimerede levetiden for G. pulex til 17-23 måneder for hunner, og 2,5 år for hanner. G. pulex og A. aquaticus findes ofte sammen, hvilket har givet anledning til adskillige studier af deres fødepræferencer (Moore 1975; Graça et al. 1993a, b), indbyrdes konkurrenceforhold (Hargeby 1990; Graça et al. 1994a, b) og rovdyr-byttedyrsinteraktioner (Bengtsson 1982). G. pulex udgør et vigtigt fødeemne for fisk, som f.eks. ørreder (Friberg 2000). Indsamlingen af G. pulex foregik ved to lokaliteter i Lindved Å på en strækning, hvor åen er klassificeret som faunaklasse 5 ud fra Dansk Vandløbsfaunaindeks, hvilket vil sige, at vandløbet betegnes som ret svagt påvirket (Fyns Amt 2003). A. aquaticus var relativt let tilgængelig og kunne indsamles sammen med G. pulex ved den ene af de to ovennævnte lokaliteter. De i forsøgene anvendte juvenile gammarider var mindre end 3 mm, mens voksne G. pulex og A. aquaticus var større end 8 mm. Denne inddeling af aldersgrupper stemmer overens med den af Welton (1979) anvendte. For G. pulex vedkommende indeholder den ikke-anvendte størrelsesgruppe på 3-8 mm en blanding af juvenile, umodne og modne voksne. Welton (1979) fandt, at den juvenile aldersklasse på alle tider af året udgjorde den største andel af populationen. Ved indsamlingen af forsøgsdyr blev juvenile A. aquaticus observeret, dog ikke i et tilstrækkelig stort antal til at kunne gennemføre forsøg med disse. 2.2 ForsøgsbetingelserOpbevaring af dyr og udførelsen af forsøg foregik i Biologisk Instituts akvarierum ved 15°C med en fotoperiode på 12 timers lys og 12 timers mørke. Ved hjemkomst til akvarierummet blev dyrene, efter et døgns temperaturakklimering i gennemluftet åvand, overført til kunstigt ferskvand (OECD 2000, ISO 6431 test water) (Tabel 1).
Dyrene blev sorteret efter størrelse ved hjælp af tre sigter med maskestørrelser på 355, 720 og 1500 µm. Voksne individer blev tilbageholdt i 1500 µm sigten, mens juvenile passerede gennem 720 µm sigten og blev tilbageholdt på 355 µm sigten. Længden af de sorterede dyr blev målt ved digital billedbehandling, og var >8 mm for voksne, og <3 mm for juvenile. Dyrene blev fodret med plantemateriale fra indsamlingsstedet, og opbevaret i 10 l plastakvarier med gennemluftet, kunstigt ferskvand. Forsøgsdyrene blev akklimeret til laboratoriebetingelser i mindst 1 uge inden forsøgsstart. Under såvel akklimering som forsøg anvendtes udelukkende kunstigt ferskvand. Vandskifte blev foretaget to gange om ugen. Forsøgsdyr, der havde været opbevaret i mere end én måned i laboratoriet, blev ikke anvendt. 2.3 PesticidvalgI forbindelse med iværksættelsen af pesticidforskningsprojekterne inden for indsatsområdet ”Vandløb og vandhuller” blev pesticider udvalgt til undersøgelse i samråd med Miljøstyrelsens Pesticidkontor bl.a. på baggrund af kriterier for anvendelse i Danmark, biologisk aktivitet og forekomst i overfladevand. Forsøg er blevet gennemført med cypermethrin, esfenvalerat, dimethoat og azoxystrobin. 2.3.1 CypermethrinCAS Nummer: 52315-07-8 Cypermethrin er et syntetisk pyrethroid-insekticid, der virker agonistisk på, d.v.s. forlænger åbningstiden af, spændingsafhængige natriumkanaler i nervesystemet hos både target og non-target organismer. I 2001 blev der i Danmark solgt 3202 kg cypermethrin til anvendelse i landbrugets planteavl, hvilket placerede cypermethrin som det fjerde mest solgte af de 10, i 2001 anvendte, insekticider, efter dimethoat, tau-fluvalinat og pirimicarb. Cypermethrin anvendes i stort set alle landbrugets afgrødetyper; det teoretisk behandlede areal udgjorde i 2001 219448 ha, hvilket er 29% af det samlede antal insekticid-behandlede hektarer; det placerer cypermethrin som det arealmæssigt mest anvendte insekticid. Af det anvendte cypermethrin sprøjtes 68% af det til korn anvendte areal. Cypermethrin anvendes med en normaldosering på 12,5-20 g/ha (Ny beregningsmetode, Bekæmpelsesmiddelstatistik 2001, Miljøstyrelsen 2002). Det var ikke muligt at finde data for cypermethrin-koncentrationer i danske ferskvandssystemer. 2.3.2 EsfenvaleratCAS Nummer: 66230-04-4 Esfenvalerat er et syntetisk pyrethroid-insekticid, der som cypermethrin virker agonistisk på spændingsafhængige natriumkanaler i nervesystemet hos både target og non-target organismer. Salget af esfenvalerat var i 2001 på 1887 kg, og esfenvalerat var det femte mest solgte insekticid, efter dimethoat, tau-fluvalinat, pirimicarb og cypermethrin. Esfenvalerat var i 2001 det arealmæssigt anden mest benyttede insekticid, efter cypermethrin, med et behandlet areal på 177258 ha, svarende til 23% af det samlede antal insekticid-behandlede hektarer. Som for cypermethrin anvendes esfenvalerat i de fleste afgrødetyper, dog især i korn, hvor 62% af arealerne sprøjtes. Normaldosering for esfenvalerat er 8,8-25 g/ha (Ny beregningsmetode, Bekæmpelsesmiddelstatistik 2001, Miljøstyrelsen 2002). Esfenvalerat er i danske vandløb fundet i koncentrationer op til 0,66 µg/l (Fyns Amt 1997; Århus Amt 1999). 2.3.3 DimethoatCAS Nummer: 60-51-5 Dimethoat er et organophosphat-insekticid, der inhiberer acetylcholinesterase-aktiviteten i nervesystemet. Dimethoat var i 2001 det mest solgte insekticid med et salg på 32987 kg, fulgt af tau-fluvalinat (5160 kg) og pirimicarb (3902 kg). Arealmæssigt var dimethoat i 2001 det tredie mest anvendte insekticid med et behandlet areal på 107977 ha, svarende til 14% af det samlede antal insekticid-behandlede hektarer. Dimethoat anvendes især i korn, men også i majs, hvor det arealmæssigt er det vigtigste insekticid. Normaldoseringen er 300-750 g/ha (Ny beregningsmetode, Bekæmpelsesmiddelstatistik 2001, Miljøstyrelsen 2002). Dimethoat er i danske vandløb fundet i koncentrationer op til 0,7 µg/l (Fyn County 2001). 2.3.4 AzoxystrobinCAS Nummer: 131860-33-8 Azoxystrobin er et strobilurin-fungicid, der inhiberer mitokondriel respiration ved at blokkere elektronoverførslen mellem cytochrom b og cytochrom c ved det ubiquinol-oxiderende site. Azoxystrobin-salget udgjorde i 2001 76689 kg, og fungicidet var det tredie mest solgte af 13, efter mancozeb (265962 kg) og fenpropimorph (104238 kg). Azoxystrobin var i 2001 det arealmæssigt mest anvendte fungicid med et behandlet areal på 304756 ha, efterfulgt af tebuconazol (197670 ha), mancozeb (177308 ha) og fenpropimorph (138984 ha). Af de i Bekæmpelsesmiddelstatistikken angivne afgrøder anvendes azoxystrobin kun i korn, med en normaldosering på 250 g/ha (Ny beregningsmetode, Bekæmpelsesmiddelstatistik 2001, Miljøstyrelsen 2002). Azoxystrobin indgår, så vidt vides, ikke i de analysemetoder, der hidtil er anvendt ved ferskvandsmonitering i Danmark. 2.4 Videosporing2.4.1 Videosporingssystemet (EthoVision Pro)Et state-of-the-art videosporingssystem, EthoVision Pro (Noldus Information Technology, Holland) blev anvendt til automatiseret adfærdsregistrering. Hardware- og softwareopsætning samt adfærdsarena- og eksponeringsdesign blev optimeret, og videosporingssystemets funktion kan opsummeres som følger (Fig. 1): et videokamera observerer objekternes bevægelser, og videobillederne overføres til en computer. Her transformeres det analoge videosignal (frame) til et digitalt signal (bitmap) v.hj.a. en frame grabber. Det digitale billede viderebehandles af computerens software (EthoVision Pro), der først detekterer objektet, dernæst bestemmer tidspunktet, og beregner objektets størrelse og position/massemidtpunkt (x,y-koordinat). Disse informationer lageres i en rådatafil, udfra hvilken EthoVision Pro siden beregner de forskellige adfærdsparametre. Systemet kan maximalt observere 16 objekter i separate arenaer samtidigt.
2.4.2 AdfærdsparametreVideosporingssystemet muliggør effektiv analyse af bevægelsesadfærd; dyrenes bevægelsesmønstre kvantificeres ved vektorregning (Fig. 2) og nedbrydes i en række adfærdsparametre. Adfærdsparametrene kan opdeles i to hovedkategorier: Afstand og tid:
Bevægelsessporets form:
Videosporingssystemets software kan for adfærdsparametrene beregne en række statistiske størrelser, såsom sum, gennemsnit, maximums- og minimumsværdi, hyppighed, varighed, spredning, etc. Beregningerne foregår i brugerdefinerede tidsintervaller, så det er muligt at opnå den ønskede tidsopløsning. Indledende studier viste, at det optimale forhold mellem en præcis beskrivelse af dyrets bevægelse og en minimering af individuel variabilitet blev opnået ved at inddele observationstiden i 5-minutters intervaller. Flere af adfærdsparametrene er interkorrelerede, og indledende undersøgelser viste, at eftersom forsøgsdyrene har en præference for at bevæge sig langs arenaens kant, og da arenaen (glaspetriskål) er rund, vil et individ, der tilbagelægger en stor vejlængde, samtidigt have drejet et stort antal grader. Bevægelsessporets form er således primært bestemt af valget af arena, og ikke nødvendigvis relateret til et adfærdstoksikologisk respons. Adfærdsparametre baseret på vinkler blev derfor ikke anvendt, og nærværende rapport indeholder ingen informationer om bevægelsessporets form. Følgende adfærdsparametre blev udvalgt for G. pulex, da de detaljeret beskriver ændringerne i adfærd forårsaget af pesticideksponering:
Opdelingen af bevægelsesadfærden i svømmeadfærd, kravleadfærd og inaktivitet er baseret på eksperimentelt bestemte kriterier for bevægelseshastighed, således at en svømme- eller kravlebevægelse påbegyndes ved overstigelse af en given startværdi og afsluttes, når bevægelseshastigheden falder til under en given stopværdi. Bevægelseshastigheden beregnes for G. pulex som den gennemsnitlige hastighed i et 1-sekunders interval. For voksne G. pulex blev hastighedskriterierne bestemt til:
Resultater for alle valgte adfærdsparametre er kun vist for voksne G. pulex eksponeret for cypermethrin. Tilsvarende beregninger er lavet for alle udførte forsøg, men for de resterende forsøg med såvel G. pulex som A. aquaticus er kun adfærdsparameteren tilbagelagt afstand vist, da den vurderes at give en tilstrækkelig detaljeret beskrivelse af det adfærdstoksikologiske respons. Endeligt udviser A. aquaticus ikke svømmeadfærd. 2.4.3 Metodeudvikling og baggrundsadfærdI projektets indledende fase blev forskellige arenatyper testet. Et flow-kammer, hvor forsøgsdyrene kunne observeres i gennemstrømmende vand, blev udviklet. Flow-kammeret med en arena afgrænset af to metalgitre er beskrevet i Bilag A, men er ikke blevet anvendt til egentlige forsøg, da forsøgsdyrene udviste for stor præference for disse gitre, hvor de kunne holde fast, og derfor ikke udviste nogen bevægelsesadfærd. Endvidere blev to parallelle strømrender udviklet. Det viste sig ikke at være muligt at holde forsøgsdyrene tilstrækkeligt længe i disse render. Strømrenderne er beskrevet i Bilag B. Valget af arena til videosporingsforsøgene faldt på glaspetriskåle. Forsøgsdyrene udviste efter akklimatisering til petriskålene tilsyneladende en forholdsvis ustresset bevægelsesadfærd, hvilket tillod observationer af såvel forøgelse som reduktion af bevægelsesaktivitet. Der er ingen vandbevægelse i de anvendte petriskåle, men såvel G. pulex som A. aquaticus ventilerer aktivt deres gæller (Maltby 1995), og klarer sig problemfrit i det stillestående vand. Vanddybden i petriskålene er kun 1,5 cm, og dette sikrer sammen med den store kontaktflade til atmosfæren tilgængeligheden af ilt. ammenhængen mellem tid tilbragt i glaspetriskåle og den tilbagelagte afstand (cm/15 min) er vist for G. pulex og A. aquaticus i Fig. 3. Der ses et markant fald i den tilbagelagte afstand i løbet af de første to timer efter overførslen til petriskålene. Dette studie blev gennemført tidligt i projektet, hvilket forklarer, at den tilbagelagte afstand er beregnet i 15-minutters intervaller, og ikke i 5-minutters intervaller som i de øvrige studier.
På grundlag af dette og en række lignende baggrundsadfærdsstudier blev det besluttet, at dyrene skal akklimatiseres i petriskålene natten over inden akutte eksponeringsforsøg. Som det fremgår af Fig. 4, hvor den tilbagelagte afstand (cm/5 min) efter akklimatisering er vist, er bevægelsesadfærden for dyr i ukontamineret vand herefter forholdsvis konstant.
2.4.4 DatabehandlingUnder alle videosporinger udarbejdes en videosporingsprotokol, hvor atypisk adfærd og mangelfuld sporing, i form af et for stort antal scan med manglende positionsbestemmelse af et dyr, noteres. Begge disse kriterier, atypisk adfærd i kontrolperioden og dårlig sporingskvalitet, er blevet anvendt til at udelade rådata fra den videre databehandling. En udeladelse af rådata begrundet med atypisk adfærd kan forekomme, hvis dyret udviser klare tegn på dårlig sundhedstilstand (f.eks. ligger helt stille) eller har et meget lavt aktivitetsniveau. Kriteriet for at udelade et dyr på grund af for lav aktivitet er empirisk bestemt til en gennemsnitlig tilbagelagt afstand <1 cm/min for G. pulex og <0,5 cm/min for A. aquaticus, beregnet som et gennemsnit i løbet af hele kontrolperioden. Det har vist sig, at dyr med så lavt et aktivitetsniveau ofte udviser manglende respons på pesticideksponering sammenlignet med de øvrige eksponerede dyr. Kriteriet skal sammenholdes med et typisk aktivitetsniveau i ukontamineret vand på ca. 20-40 cm/min for G. pulex og ca. 10-15 cm/min for A. aquaticus. Dyr ekskluderes ligeledes fra videre analyse, hvis antallet af scans med manglende positionsbestemmelse overstiger 1% af det samlede antal scans. Erfaringer viser, at det normalt er nødvendigt at ekskludere data for 0-1 dyr ved videosporing af 16 arenaer. 2.5 Adfærdstoksikologisk e forsøg2.5.1 Akut adfærdstoksicitet af udvalgte pesticiderFormålet med de akutte adfærdstoksikologiske studier var at undersøge de ændringer i bevægelsesadfærd, der måtte finde sted under en miljørealistisk, kortvarig pesticidpuls. Ud fra de foreliggende data for pulsvarigheder (internt følgegruppenotat med overvejelser omkring pulseksponering) blev det besluttet at følge adfærdsresponset under en 90-minutters eksponering. Designet af et standardforsøg er følgende: Dyrene akklimeres natten over i glaspetriskåle med en indre diameter på 90 mm. Alle 16 dyrs baggrundsadfærd registreres derefter i 30 minutter i 80 ml ukontamineret vand. Dernæst afbrydes videosporingen midlertidigt. Det udvalgte pesticid, opløst i 10 µl ethanol + 20 ml vand, tilføres 8 af petriskålene (den eksponerede gruppe). De resterende 8 petriskåle (kontrolgruppen) tilføres 10 µl ethanol + 20 ml vand. Tilsætningen af de 20 ml væske foretages længst muligt fra dyrets position, og videosporingen genoptages 2 minutter efter afbrydelsen. Kontrolgruppens og den eksponerede gruppes adfærd følges derefter i yderligere 90 minutter, hvorefter forsøget afsluttes og vandprøver indsamles. Den endelige koncentration af ethanol var 100 µl/l, hvilket er i overensstemmelse med OECD Test guidelines (OECD 2000). En oversigt over udførte studier af akut adfærdstoksicitet er givet i Tabel 2.
2.5.2 Relativ følsomhed af juvenile Gammarus pulexFor at vurdere forskellige livsstadiers relative følsomhed over for en pyrethroid-eksponering blev det akutte adfærdsrespons hos juvenile G. pulex undersøgt ved samme nominelle cypermethrin-koncentrationer som tidligere nævnt for voksne (Tabel 2). Under forsøget blev dyrenes baggrundsadfærd, efter akklimering natten over i petriskåle med en indre diameter på 35 mm, fulgt i 30 minutter. Dyrene blev herefter eksponeret i 90 minutter under fortsat adfærdsregistrering. 2.5.3 Restituering efter esfenvalerat-eksponeringMed baggrund i pyrethroidernes observerede virkemekanisme (forøget aktivitet efterfulgt af immobilisering i løbet af minutter ved miljørealistiske koncentrationer) samt foreliggende data for varighed af pesticidpulse i vandløb blev et restitueringsforsøg gennemført. Formålet med restitueringsforsøget var at følge adfærden efter en enkelt-puls-eksponering for at vurdere, hvorvidt dyrene er i stand til at komme sig igen. De valgte koncentrationer (Tabel 3) muliggør undersøgelse af restitueringsevnen efter forskellige grader af adfærdsændringer i eksponeringsperioden, fra forøget aktivitet til immobilisering. I forsøget blev dyrenes baggrundsadfærd, efter akklimering natten over, fulgt i 30 minutter. Dyrene blev herefter eksponeret i 90 minutter, mens deres adfærd blev registreret. Dernæst blev dyrene, efter gentagne, forsigtige skylninger i rent vand, overført til ukontamineret vand. Efter en 24-timers restitueringsperiode blev adfærden registreret i en 2-timers periode i ukontamineret vand.
2.5.4 KombinationseksponeringEt studie af den akutte adfærdstoksicitet ved eksponering af voksne G. pulex for en kombination af pyrethroiderne cypermethrin og esfenvalerat blev gennemført. Formålet med forsøget var at illustrere videosporingssystemets anvendelighed i forbindelse med studier af kombinationseksponeringer. I alt 9 eksponeringer blev anvendt (Tabel 4). Under forsøget blev dyrenes baggrundsadfærd, efter akklimering natten over, fulgt i 30 minutter. Dyrene blev herefter eksponeret i 90 minutter under fortsat adfærdsregistrering.
2.6 MortalitetsstudierMortalitets- og immobiliseringsstudier blev gennemført for cypermethrin, esfenvalerat og dimethoat med eksponering af juvenile og voksne G. pulex. Endvidere blev mortalitet og immobilisering hos A. aquaticus eksponeret for esfenvalerat undersøgt. Der blev ikke gennemført mortalitetsforsøg med azoxystrobin. En oversigt over mortalitetsstudierne er givet i Tabel 5. 24 timer inden påbegyndelse af eksponering blev voksne dyr overført til 1,0 l pyrex krystallisationskar indeholdende 400 ml kunstigt ferskvand, mens juvenile dyr blev overført til 250 ml pyrex bægerglas indeholdende 80 ml kunstigt ferskvand. Ved hver eksponeringskoncentration blev 2 grupper af 10 juvenile/bægerglas og 2 grupper af 10 voksne/krystalisationskar anvendt. Inden eksponeringens begyndelse blev døde individer erstattet af ligeledes akklimerede dyr, og det udvalgte pesticid, opløst i ethanol + 100 ml vand for voksne og 20 ml vand for juvenile, blev forsigtigt tilsat til et slutvolumen på 500 ml for voksne og 100 ml for juvenile dyr. Der blev anvendt to kontrolgrupper; en kontrolgruppe fik udelukkende tilsat kunstigt ferskvand, mens en solventkontrolgruppe fik tilsat ethanol i kunstigt ferskvand. Den endelige koncentration af ethanol var 100 µl/l, som det var tilfældet ved videosporingsforsøgene, hvilket er i overensstemmelse med OECD Test guidelines (OECD 2000). Efter 24, 48, 72 og 96 timer blev dyrene talt og inddelt i tre grupper: mobile, immobile og døde. Individer blev identificeret som mobile, hvis de var aktive umiddelbart under observationen eller ved en minimal mekanisk stimulering. Immobile var de individer, der ikke reagerede på mekanisk stimulus, men ved observation i stereolup kunne iagttages at bevæge kropslemmer som f.eks. antenner eller ben. Døde dyr kunne som regel let identificeres, da de udviste markant farveskifte og/eller slet ikke reagerede på mekanisk stimulering eller udviste bevægelser ved observation i stereolup. Efter optællingerne ved 24, 48 og 72 timer blev der foretaget vandskifte. 400 ml vand for voksne og 80 ml vand for juvenile blev forsigtigt hældt fra, og et tilsvarende volumen frisk vand indeholdende ethanol og pesticid blev forsigtigt tilsat. Dette blev gjort for at minimere håndteringsstress.
2.7 PesticidkvantificeringFor at opnå realistiske dosis-respons forhold ønskedes de reelle koncentrationer af pesticider bestemt i eksponeringssystemerne. 2.7.1 MetodebeskrivelseMetodens princip er baseret på fastfaseekstraktion af pesticidkontamineret kunstigt ferskvand efterfulgt af opkoncentrering ved inddampning, samt kvantificering ved omvendt fase HPLC-MS. Metoden er baseret på vandprøver med et volumen på 100 ml.
2.7.1.1 Fastfaseekstraktion Ekstraktionen af pesticiderne fra vandprøven foretages på en C18-søjle (Sep-Pak Vac, 3 cc, 500 mg, C18 cartridges, fra Waters). Søjlen konditioneres med 5 ml methanol, og vaskes med 5 ml Milli-Q vand. Prøven påsættes søjlen ved 20 kPA vacuum, svarende til ca. 3 ml/min. Dernæst vaskes søjlen med 5 ml Milli-Q vand, og tørres i 1-2 min ved 30-40 kPa vacuum. Pesticidet elueres med 8 ml methanol for cypermethrin og esfenvalerat og 4 ml methanol for dimethoat og azoxystrobin, og inddampes efterfølgende til tørhed under luftstrøm. Cypermethrin- og esfenvaleratprøver genopløses i 0,300 ml 75% methanol, mens dimethoat- og azoxystrobinprøver genopløses i 0,500 ml eluent A (methanol:10 mM ammoniumacetat, 10:990 (v:v)). Prøverne overføres til 2 ml vials og er klar til LC-MS. Denne ekstraktionsprotokol er fremkommet ved testning af flere forskellige ekstraktionssøjler.
2.7.1.2 LC-MS analyse Det anvendte Hewlett Packard LC-MSD-system består af en HP Series 1100 HPLC (solvent degasser, binær pumpe, autosampler og termostatreguleret kolonneafdeling) og et G1946A MSD quadropole massespektrometer udstyret med electrospray ionisation (ESI) i positiv mode til cypermethrin og esfenvalerat, og atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) i positiv mode til dimethoat og azoxystrobin, som ioniseringsprincipper. Samme HPLC-kolonne (C18, 150×2,1 mm, Phenomenex fra Subware) med forkolonne af samme materiale anvendes til kvantificering af alle fire pesticider i de ekstraherede prøver. For cypermethrins og esfenvalerats vedkommende blev en C8-kolonne testet, men ikke anvendt, da signalet var mindre. Der anvendes et væske-flow på 0,4 ml/min, en injection af 50 µl prøve, og en kolonnetemperatur på 25°C. Følgende LC solventer blev brugt til alle fire pesticider: Eluent A: methanol:10 mM ammoniumacetat, 10:990 (v:v). Eluent B: methanol:10 mM ammoniumacetat, 90:10 (v:v). For cypermethrins og esfenvalerats vedkommende blev de af Spliid et al. (1998) beskrevne LC solventer til ESI (Eluent A: methanol:20 mM eddikesyre, 10:90 (v:v); Eluent B: methanol:20 mM eddikesyre, 90:10 (v:v)) afprøvet med ringere resultat. 2.7.2 CypermethrinCypermethrin elueres med følgende gradient (Tid, % B): (0 min, 75%); (3 min, 100%); (15 min, 100%); (15,1 min, 75%); postrun-tid: 6 min, 25% B. Cypermethrin elueres som en dobbelt-top med maksimal intensitet ved 7,7 minutter. Massespektrometer-opsætning: Mode: ESI positiv (SIM: m/z 433). Drying gas temperature: 350 °C. Drying gas flow: 10 l/min. Nebulizer pressure: 40 psig. Capillary voltage: 5000 V. Fragmentor: 50 V. Der benyttes ekstern standardisering, og standardkurven beregnes udfra standarderne: 10, 50, 250 og 1250 ng/ml injiceret standard.2.7.3 EsfenvaleratEsfenvalerat elueres med følgende gradient (Tid, % B): (0 min, 75%); (3 min, 100%); (15 min, 100%); (15,1 min, 75%); postrun-tid: 6 min, 25% B. Esfenvalerat elueres efter 8,7 minutter. Massespektrometer-opsætning: Mode: ESI positiv (SIM: m/z 437). Drying gas temperature: 350 °C. Drying gas flow: 10 l/min. Nebulizer pressure: 30 psig. Capillary voltage: 3500 V. Fragmentor: 50 V. Der benyttes ekstern standardisering, og standardkurven beregnes udfra standarderne: 5, 10, 50, 250 og 1250 ng/ml injiceret standard. 2.7.4 DimethoatDimethoat elueres med følgende gradient (Tid, % B): (0 min, 25%); (12 min, 100%); (13 min, 100%); (13,1 min, 25%); postrun-tid: 6 min, 25% B. Dimethoat elueres efter 7,5 minutter. Massespektrometer-opsætning: Mode: APCI positiv (SIM: m/z 230). Drying gas temperature: 350 °C. Drying gas flow: 2,5 l/min. Nebulizer pressure: 40 psig. Vaporizer temperature: 500 °C. Corona current: 8,0 µA. Capillary voltage: 2500 V. Fragmentor: 70 V. Der benyttes ekstern standardisering, og standardkurven beregnes udfra standarderne: 2, 10, 25, 50, 250 og 1250 ng/ml injiceret standard. 2.7.5 AzoxystrobinAzoxystrobin elueres med følgende gradient (Tid, % B): (0 min, 25%); (2 min, 75%); (8 min, 100%); (9 min, 100%); (9,1 min, 25%); postrun-tid: 6 min, 25% B. Azoxystrobin elueres efter 7,5 minutter. Massespektrometer-opsætning: Mode: APCI positiv (SIM: m/z 404). Drying gas temperature: 350 °C. Drying gas flow: 2,5 l/min. Nebulizer pressure: 40 psig. Vaporizer temperature: 350 °C. Corona current: 8,0 µA. Capillary voltage: 3500 V. Fragmentor: 70 V. Der benyttes ekstern standardisering, og standardkurven beregnes udfra standarderne: 2, 10, 50, 250 og 1250 ng/ml injiceret standard. 2.7.6 MetodevalideringEn reduceret metodevalidering blev gennemført i overensstemmelse med retningslinier for validering af biologiske analyser (Braggio et al. 1996; Causon 1997). Genfinding og intra-assay-præcision blev bestemt ved oprensning og analyse af 6 spikede prøver à 100 ml kunstigt ferskvand med følgende koncentrationer: cypermethrin: 1000 ng/l, esfenvalerat: 250 ng/l, dimethoat: 250 ng/l og azoxystrobin: 100 ng/l. Intra-assay-præcisionen blev beregnet som den procentvise variationskoefficient (% C.V.), hvilket er synonymt med den relative standardafvigelse (RSD), for disse 6 prøver. Detektionsgrænser for de fire pesticider blev bestemt ved oprensning og analyse af 6 spikede prøver à 100 ml kunstigt ferskvand med følgende koncentrationer: cypermethrin: 250 ng/l, esfenvalerat: 50 ng/l, dimethoat: 100 ng/l og azoxystrobin: 20 ng/l. Detektionsgrænserne blev beregnet som 3 gange standardafvigelsen for disse 6 prøver. Resultaterne for genfinding, intra-assay-præcision og detektionsgrænser fremgår af Tabel 6. 2.7.7 Nominelle koncentrationerI forbindelse med færdiggørelsen af LC-MS metodevalideringen blev det observeret, at især cypermethrin nedbrydes hurtigt under prøveforberedelse og –analyse. Halveringstider ned til under et døgn blev registreret, hvilket umuliggjorde kvantificering af tidligere indsamlede vandprøver, der havde været opbevaret i et halvt år. Esfenvalerat viste sig at være mere stabilt, men heller ikke for dette pesticid var det muligt at kvantificere tidligere indsamlede vandprøvers indhold. Alle eksponeringskoncentrationer for cypermethrin og esfenvalerat er i nærværende rapport angivet som nominelle. Årsagen til den hurtige forsvinden af cypermethrin er endnu ikke kendt, men kunne skyldes fotolyse eller adsorption til glasvarer. Ved fremtidige studier af pyrethroiders effekter vurderes anvendelsen af esfenvalerat som modelforbindelse samt en mere veldefineret protokol for vandprøveindsamling at kunne sikre kvaliteten af LC-MS-kvantificeringen. For dimethoat og azoxystrobin blev eksponeringskoncentrationerne bestemt. 2.8 StatistikStatistisk evaluering blev foretaget ved hjælp af SigmaStat (version 2.03, SPSS Inc., Chicago, IL). Resultater fra videosporingsforsøgene blev evalueret med repeated measures ANOVA og t-test. Om nødvendigt blev data transformeret for at opfylde betingelser om normalitet og varianshomogenitet (Zar, 1984). Studier af mortalitet og immobilisering blev evalueret med logistisk regressionsanalyse. Et signifikansniveau på α = 0,05 blev anvendt i alle statistiske analyser. Det anvendte design for videosporingsforsøgene med kun en forsøgsrunde pr. pyrethroid-koncentration er evalueret v.hj.a. statistiske styrkeberegninger i Bilag C. |
