| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Effekter af cypermethrin, azoxystrobin og bentazon på limniske invertebrater

4 Diskussion

4.1 Cypermethrin

4.1.1 Overlevelse

Koncentration-respons
Resultaterne af koncentration-responsforsøgene viste, at gruppen af makroinvertebrater var mere sensitive over for cypermethrin end zooplanktonet. Særlig sensitive var døgnfluenymfen C. dipterum-gr. og myggelarverne C. plumosus og C. flavicans med EC₅₀ i intervallet 0,02 – 0,06 µg cypermethrin l^-1. Dette EC₅₀ niveau harmonerer med litteraturværdier for C. dipterum-gr. efter 24 timers eksponering, hvor EC₅₀ angives til 0,07 µg cypermethrin l^-1 og for myggelarver efter 24 timers eksponering, hvor EC₅₀ angives til 0,03 – 0,2 µg cypermethrin l^-1 (Stephenson, 1982). Makroinvertebraternes større sensitivitet kan muligvis forklares ved en tættere beslægtning med målorganismerne (insekter) for pesticidet.

Copepoden E. graciloides og cladoceen D. galeata var de mest sensitive zooplanktonarter med en EC₅₀ i den lave ende af det EC₅₀/LC₅₀ interval på 0,12 - 5 µg l^-l, der er opgivet i litteraturen for zooplankton eksponeret for cypermethrin (Day, 1989). Neonate D. magna, som anvendes som standardtestorganismer i godkendelsesproceduren for pesticider, havde derimod en EC₅₀, som lå i den høje ende af intervallet, og kan derfor ikke karakteriseres som værende blandt de mest sensitive af de testede zooplanktonarter.

Neonate D. magna var mere sensitive over for cypermethrin end voksne ægbærende D. magna. Størrelsesrelaterede variationer i sensitivitet over for kemiske stoffer er beskrevet for zooplankton i tidligere studier. Forsøg med den marine copepod Arcartia tonsa eksponeret for cypermethrin viste signifikante forskelle i sensitivitet mellem nauplier og voksenindivider i en 96 timers akut test (Medina et al., 2002) og Lotufo & Fleeger (1997) fandt også, at nauplier var mere sensitive end voksne copepoder ved eksponering for polycycliske aromatiske hydrocarboner (PAH). Forsøg med dafnier eksponeret for insekticiderne fenvalerate og carbaryl og herbicidet bromoxynil har ligeledes vist, at juvenile dafnier er mere sensitive end voksne individer (Buhl et al. 1993; Hanazoto, 1991, Day et al., 1987). Unge og voksne stadier kan være lige sensitive hvad angår stoffets toksicitet, men individstørrelse påvirker de kinetiske rater såsom optagelse og udskillelse, hvilket er afgørende for, hvornår der opstår en lethal koncentration af pesticidet i individet (Rand et al., 1995). Eksempelvis er kontaktfladen til pesticidet større for neonate end voksne dafnier i forhold til deres volumen, hvilket giver anledning til en forholdsmæssig større pesticidoptagelse, forudsat at optagelsen sker over organismens ydre overflade. Et mere veludviklet enzymsystem hos voksne individer øger også evnen til detoksificering af pesticidet (McKim, 1995). Endelig kan antallet af hudskifter påvirke sensitiviteten, og unge individer har flere hudskifter end voksenindivider. Hos dafnier og krabber er der fundet større sensitivitet hos individer, der netop har haft hudskifte sammenlignet med individer, hvor der er gået længere tid siden sidste hudskifte (Mothershead et al., 1992; Gliwicz et al., 1986). Øget permeabilitet og vandoptagelse og nedsat metabolisme af fremmedstof under hudskifte foreslås som mulige årsager (Mothershead et al., 1992). Selv om der kunne ses en effekt af individstørrelsen på sensitiviteten inden for arten D. magna, kunne individstørrelse ikke forklare forskellene i sensitivitet mellem arter. Eksempelvis var C. sphaericus den mindste af de testede arter og samtidig den mindst sensitive art, mens den største art C. plumosus var blandt de mest sensitive arter.

Ud fra størrelsesmæssigt sammenlignelige populationer af D. galeata, henholdsvis indsamlet i felten og dyrket som laboratoriekulturer, kunne der ikke konstateres nogle signifikante forskelle i EC₅₀. Den større tolerance hos D. magna sammenlignet med det øvrige zooplankton kan heller ikke ud fra det foreliggende datamateriale tilskrives, hvorvidt forsøgspopulationerne stammer fra laboratoriekulturer eller naturlige populationer. Det var ellers forventet, at organismer, der var indsamlet i felten, ville være mere følsomme end laboratoriestammer, p.g.a. at livsvilkårene under naturlige forhold ofte er suboptimale og derved udgør en stressfaktor, som øger individernes følsomhed over for pesticider.

Individernes akutte respons var generelt negativt påvirket af eksponeringstiden. For arter som fx. D. magna og C. flavicans var der et stort fald i EC₅₀ med tiden, mens der for arter som E. graciloides, C. sphaericus og C. dipterum-gr. ikke var forskel i EC₅₀ efter 24 og 48 timers eksponering. Tolerancetærsklen og raten af optagelse og udskillelse/detoksificering af pesticidet samt individstørrelsen er af betydning for, hvornår et tidsuafhængigt respons nås. Det vil sige, at det er muligt, at E. graciloides, C. sphaericus og C. dipterum-gr. allerede efter 24 timers eksponering havde nået effektniveauet for tidsuafhængigt respons og derfor ikke kunne forventes at blive yderligere påvirket af pesticidet. Derimod kunne fx. D. magna eventuelt forventes at blive stærkere påvirket ved eksponering ud over de 48 timer. Tidspunktet for det tidsuafhængige respons er under naturlige forhold af betydning i sammenhæng med varigheden af pesticidets til stedeværelse i økosystemet, og dermed om maksimal effekt af stoffet kan forventes. Jo hurtigere det tidsuafhængige (maksimale) respons indtræder, desto mere såbar vil arten sandsynligvis være over for pesticidet, idet en given pesticidkoncentrationen ved pulstilførsel vil falde med tiden blandt andet p.g.a. nedbrydning.

I koncentration-responsforsøgene med D. magna, C. plumosus og C. flavicans var iltindholdet efter 48 timer nede omkring 2 - 3 mg O₂ l^-l, uden at der dog blev observeret døde individer i kontrolbehandlingerne. Som beskrevet i afsnit 2.2 kan disse arter tolerere meget lave iltkoncentrationer (< 2 mg O₂ l^-1) og for C. plumosus’ vedkommende også over lange perioder. Der er derfor ingen grund til at antage, at de relativt lave iltkoncentrationer har haft indflydelse på forsøgsresultaterne.

I koncentrations-responsforsøgene blev den laveste NOEC-værdi på 0,005 µg cypermethrin l^-1 observeret for C. flavicans efter 48 timers eksponering, men også C. plumosus,C. dipterum-gr. og D. galeata (L) havde lave NOEC. Kun få af de fastlagte NOEC kunne reelt blive accepteret som nul effektkoncentrationer, fordi der rent faktisk kunne forventes en betydelig effekt på populationen ved disse koncentrationer. Ved kun 20 % af NOEC-værdierne kunne det forventes, at ≤ 5 % af forsøgspopulationen ville immobiliseres. Det lave antal af acceptable NOEC-værdier skal findes i, at fastlæggelsen af NOEC afhænger af antallet af teststofkoncentrationer, de anvendte koncentrationer og fortyndingsfaktoren (European Commission, 1995). Det vil sige, at er der et kraftigt respons mellem to koncentrationer (eks. 0 – 50 % effekt), vil det kunne afspejle sig i en høj forventet effekt ved NOEC-værdien.

Reproduktion
I reproduktionsforsøgene blev flere effektparametre undersøgt, bl.a. ægudviklingstid, udviklingstid for unger, kuldstørrelse og længde af moderdyr ved reproduktion. NOEC og LOEC værdier kunne derfor variere for den enkelte art afhængig af, hvilken parameter der blev valgt. Ved sammenligning af EC-værdier mellem arterne blev derfor anvendt den mest sensitive parameter.

I cypermethrinforsøgene viste det sig, at hvis zooplanktonet havde udviklet æg, skete der også en videreudvikling til neonate dafnier eller nauplier. Det eneste, som forhindrede dannelsen af unger, var, at moderdyrene døde som følge af en for høj cypermethrinkoncentration. Dette skete ved koncentrationer på 0,06 (forsøg 1), 0,08 og 0,5 µg cypermethrin l^-1 for hhv. D. magna, D. galeata og C. vicinus. Et af D. magna forsøgene viste effekt på reproduktionen ved en så lav koncentration som 0,04 µg cypermethrin l^-1 (LOEC). Her døde 80 % af dyrene, og de overlevende udviklede ikke æg. Dette er i overensstemmelse med Day et al. (1987) og Miljøstyrelsen (1990), som påviste subletale effekter ved 0,01 – 0,06 µg cypermethrin l^-1. Et efterfølgende forsøg viste imidlertid en NOEC større end 0,08 µg cypermethrin l^-1. Dette dokumenterer, at effektkoncentrationer kan variere inden for samme art fra det ene forsøg til det andet, hvilket også er kendt fra litteraturen (Møhlenberg et al., 2001).

Forsøgene med D. galeata viste en NOEC på 0,04 µg cypermethrin l^-1 og en LOEC på 0,05 µg cypermethrin l^-1, hvor ægudviklingstiden blev forlænget signifikant, ligesom der udvikledes et mindre kuld neonate dafnier. Hos C. vicinus blev reproduktionstiden også forlænget, her var det imidlertid udviklingstiden for naupliedannelsen, der blev forlænget. Den mest sensitive parameter for C. vicinus var kuldstørrelsen, som blev reduceret ved 0,04 µg cypermethrin l^-1 (LOEC). NOEC var 0,03 µg cypermethrin l^-1.

Sammenlignes D. magna, D. galeata og C. vicinus var de lige sensitive i forhold til cypermethrin, idet de blev påvirket på den ene eller anden måde ved koncentrationer mellem 0,04 og 0,05 µg cypermethrin l^-1. Inddrages resultaterne fra det andet D. magna forsøg, var D. galeata den mest sensitive organisme af de to. Day og Kaushik (1987a) har tidligere vist, at D. galeata mendotae kan være meget sensitiv over for pyrethroidet fenvalerate. Betragtes udviklingstiden alene var D. galeata den mest sensitive med en LOEC på 0,05 µg cypermethrin l^-1 mod 0,1 µg cypermethrin l^-1 for C. vicinus. I forbindelse med sammenligningen skal nævnes, at de anvendte D. magna var yngre end de øvrige arter ved starten af pesticidpåvirkningen. I litteraturen er det vist, at juvenile dyr er mere sensitive end voksne individer (jf. 4.1.1 (Koncentration-respons)), og på den baggrund antager vi, at forskellen i sensitivitet mellem de to dafnie-arter ville have været større, hvis der havde været anvendt voksne individer af D. magna.

I forhold til koncentrations-respons forsøgene var der overensstemmelse på den måde, at D. galeata var mere sensitiv end D. magna, dette hænger også sammen med teorien om øget optagelsesrate ved reduceret individstørrelse (Rand et al., 1995). Det behøver dog ikke være hele forklaringen, da fx. C. sphaericus (den mindste af de testede zooplanktonarter) var den mindst sensitive i koncentration-respons forsøgene. Det kan diskuteres, hvorvidt C. vicinus resultaterne kan sammenlignes med dafnie-resultaterne, da C. vicinus blev indsamlet i felten i modsætning til dafnierne, som var rene laboratoriestammer. C. vicinus kan herved have været relativ mere sensitiv end en tilsvarende laboratoriekultur p.g.a. flere stresspåvirkninger. Koncentration-respons forsøgene med hhv. laboratorie- og feltkulturer af D. galeata viste imidlertid ikke sådanne tegn, hvor sammenligningen er foretaget.

E. graciloides viste ikke tegn på påvirkninger ved de anvendte koncentrationer. På baggrund af koncentration-respons forsøgene, hvor den var blandt de mest sensitive arter, ville vi ellers forvente effekter ved den valgte koncentrationsgradient. Årsagen er formentlig, at den valgte metode ikke er sammenlignelig med metoderne anvendt ved de andre zooplanktonarter. E. graciolides blev indsamlet i felten som ægbærende voksne individer, som umiddelbart herefter blev eksponeret (se afsnit 2.4.3). Det betød en forholdsvis kort eksponeringstid over for cypermethrin sammenlignet med eksponeringstiden for de øvrige arter, hvilket også betyder, at risikoen for påvirkninger reduceres.

En kontinuert påvirkning med en cypermethrinkoncentration på fx. 0,08 µg cypermethrin l^-1 ville betyde forøget dødelighed hos begge dafnie-arter, en længere generationstid hos de overlevende D. galeata samt reduceret kuldstørrelse hos både D. galeata og C. vicinus. Alle er faktorer, som vil resultere i færre zooplanktonindivider og specielt færre filtratorer i form af dafnier. Konsekvensen heraf vil være en reduceret græsningskapacitet på algerne.

4.1.2 Adfærd

Fysiologisk respons
Resultaterne af videoregistreringsforsøgene med D. magna viste, at alle 4 responsparametre blev påvirket af cypermethrin. Aktiviteten af hjerte og bagklo blev forøget, mens aktiviteten af brystlemmer og mandibler blev reduceret ved cypermethrineksponering.

Bagkloen var den mest sensitive parameter og samtidig også den parameter, hvor responset var lettest og mest entydigt at registrere. En signifikant effekt i forhold til kontrolaktiviteten blev observeret ved 0,1 µg cypermethrin l^-1 svarende til EC_5,4 målt som immobilitet for ægbærende D. magna. På den baggrund kan bagkloen karakteriseres som en sensitiv og nemt registrerbar parameter til måling af subletal cypermethrintoksicitet. Yderligere vil vi forvente, at der også kan registreres effekter på bagkloen ved koncentrationer lavere end 0,1 µg cypermethrin l^-1. Derimod var aktiviteten af hjertet ikke en sensitiv responsparameter, idet der først blev registreret en signifikant effekt i forhold til kontrolaktiviteten ved EC₄₁ for ægbærende D. magna, dvs. ved koncentrationer, som reducerer overlevelsen betydeligt. Hjerteaktivitet er derfor et uegnet effektkriterie for registrering af subletal effekt af cypermethrin.

Som i koncentration-responsforsøgene var effekten på de fysiologiske parametre afhængig af eksponeringstiden. På flere parametre kunne der ses effekter allerede efter 15 minutters eksponering, mens effekten på de fleste parametre var stabil efter omkring 6 timers eksponering. For mandiblerne var der ved visse eksponeringskoncentrationer tendens til restitution, selv om der stadig var en signifikant påvirkning.

Subletale koncentrationer af cypermethrin er kendt for at give en tilstand af lammelse, hvorfra restituering kan ske (Sattelle & Yamamoto, 1988; Bloomquist et al., 1986). Undersøgelser af bevægelsesadfærd hos terre-striske edder-kopper har vist, at koordineret bevægelse og thigmotaxis gradvist, og afhængig af køn, restitueres 12 – 36 timer efter en puls-eksponering for subletale cypermethrinkoncentrationer. Edderkoppernes evne til at bevæge sig med deres initielt maksimale bevægelseshastigheder mangler dog stadig 9 dage efter cypermethrineksponeringen (Baatrup et al., 1993). Det antyder i forlængelse af resultaterne for D. magna, at nogle effekter restitueres hurtigere end andre. Udførelse af bevægelser med høj hastighed vil formentlig kræve en høj grad af neuronal kontrol og kan derfor forventes at blive særlig påvirket af en nervegift som cypermethrin.

Den økofysiologiske funktion af dafniens vedvarende bevægelse af brystlemmerne er at frafiltrere og tilbageholde fødepartikler, der føres med vandstrømmen ned gennem de to skjolddele, mens mandiblerne behandler fødepartiklerne, inden de føres til spiserøret og synkes. Fødepartiklerne føres til mandiblerne via en ventralt placeret fødefure, der kan renses ved bevægelse af bagkloen, hvis den er fyldt af for mange eller uhåndterbare fødepartikler (Lampert, 1987). Aktiviteten af brystlemmerne stoppes, når bagkloen er i bevægelse. Cypermethrin kan derfor potientelt reducere fødeoptagelsen hos D. magna ved at reducere brystlemme- og mandibelaktiviteten og forøge antallet af afvisninger af fødeemner, dvs. forøge bevægelsen af bagkloen. Under naturlige forhold kan fx. kolonidannende blågrønalger, pansrede og trådformede alger også reducere fødeoptagelsen (Lampert, 1987; Gliwicz, 1980), og effekten af cypermethrin og lignende pesticider, som reducerer D. magna’s filtrereringsaktivitet, skal ses som en yderligere kilde til reduktion af fødeoptagelsen.

Pesticiders effekt på fødeoptagelsen hos zooplankton er tidligere undersøgt i laboratorie- og feltforsøg. F.eks. er subletale koncentrationer af fenvalerate (0,01 µg l^-1) påvist at reducere dafniers filtreringsaktivitet, og filtrationsrater for hele zooplanktonsamfund reduceres ved en fenvaleratekoncentration på 0,05 µg l^-1 (Day et al., 1987). Pesticideffekter direkte på aktiviteten af lemmer mm. der anvendes i fødeoptagelsesprocessen er derimod sjældent undersøgt. Gliwicz & Sieniawska, (1986) har dog vist, at subletale lindan koncentrationer reducerer brystlemme- og mandibelaktiviteten hos D. pulex.

Svømmehastighed
Dafniers evne til at foretage både horisontale og vertikale vandringer under naturlige betingelser er velkendt og kan relateres til forhold i det omgivende miljø som fx. til stedeværelse af føde og prædatorer (Christoffersen & Bosselmann, 1997; Lauridsen et al., 1997). De indledende forsøg viste imidlertid, at dafnie-arter og -kloner holdt i kulturer tilsyneladende kan mangle evnen til at foretage vandringer udløst af en lysstimulus. Dette er sandsynligvis en konsekvens af, at denne type respons ikke har nogen betydning for populationen under de givne forhold.

Den begrænsede eller manglende respons hos dafnier fra laboratoriekulturer må derfor tages i betragtning ved økotoksikologiske studier med retningsbestemt svømmeadfærd som effektkriterie.

Svømmehastighederne opnået i kontrolforsøgene er sammenlignelige med værdier opnået i andre studier af D. magna eller tilsvarende store cladoceer. Der er rapporteret om gennemsnitlige svømmehastigheder målt vha. videofilmning eller visuelle observationer fra 0,2 m min^-1 (Baillieul & Blust, 1999) til 0,9 m min^-1 (Larsson et al., 2000).

Den negative effekt af cypermethrin på D. magna‘s evne til at foretage en retningsbestemt svømmeaktivitet var særdeles udtalt og medførte en reduktion i den maksimale svømmehastighed på 10-68% (figur 32) og nedsatte den gennemsnitlige svømmehastighed tilsvarende (tabel 14). Samme respons er fundet af Baillieul og Blust (1999), som undersøgte effekten af cadmium på D. magna. Reduktionen i svømmehastigheden var relateret til koncentrationen af cadmium og til størrelsen af forsøgsdyrene. Porter et al. (1982), Dodson et al. (1995) og Baillieul og Blust (1999) har desuden samstemmende vist, at der er klar sammenhæng mellem en reduceret hhv. svømmehastighed og observerede ændringer i fysiologiske og adfærdsmæssige forhold.

Ændringerne i den maksimale svømmehastighed opnået i dette projekt viste en klar sammenhæng med cypermethrinkoncentrationen. Relationen kunne beskrives med en eksponentiel aftagende funktion (y = 78,6 e^-0,91x, R² = 0,91), hvor hældningen var signifikant forskellig fra 0.

Der er hidtil kun lavet få studier af toksiske stoffers indvirken på svømmeaktiviteten hos zooplankton, men resultaterne fra disse studier og fra dette projekt er, at svømmeaktiviteten er en følsom parameter, som repræsenterer væsentlige fysiologiske mekanismer (jf. afsnit 4.1.2 (Fysiologisk respons)). Denne parameter er derfor velegnet som effektkriterie i økotoksikologiske test.

Den økologiske konsekvens af en reduceret svømmehastighed kan illustreres med et eksempel.

Gammelmosen, hvor den anvendte population af D. magna findes, er en lavvandet sø (1-3 m dyb) på 3,8 ha og med en veludviklet littoralzone (5-10 bred) med emergente vandplanter (primært tagrør). Søen har en ringe fiskebestand, og der kan derfor i perioder opbygges tætte bestande af dafnier. Disse skal dog sameksistere med de eksisterende fisk og med invertebrat-prædatorer, bl.a. Chaoborus flavicans, hvilket er muligt, da dafnierne kan vandre ind i littoralzonen med planter i de lyse timer, hvor de er mest udsat for prædation.

Søen er ca. 150 m bred og 250 m lang. Hvis det antages, at D. magna populationen vil fordele sig ligeligt over hele søen, når forholdene tillod det (om natten), så vil den enkelte dafnie gennemsnitligt skulle svømme 100 m for at nå ind og ud af littoralzonen. Med en maksimal svømmehastighed, 0,85 m min^-1 (gennemsnit af værdier fra alle kontrolforsøg), vil det tage ca. 2 timer at svømme en distance på 100 m. Hvis det videre antages, at en cypermethrinkoncentration på 0,5 ug l^-1 realistisk set kan forekomme i en sø eller et vandhul i et landbrugsområde (se afsnit 1.2.1), vil den maksimale svømmehastighed være reduceret til 0,41 m min^-1, og dermed skal dafnierne bruge lidt over 4 timer på at tilbagelægge 100 m.

Ved at anvende den tilnærmede gennemsnitlige svømmehastighed vil scenariet være endnu mere udtalt, idet de 100 m vil tage over 4 timer at svømme for et ueksponeret dyr og 12 timer for et dyr eksponeret for 0,5 µg cypermethrin l^-1.

En forøgelse af den tid, dafnier skal bruge på at svømme, medfører dels, at der er mindre tid til at optage føde, og dels at risikoen for at blive opdaget som bytte øges. Begge forhold vil betyde mindre overlevelse og vækst af dafnie-populationen. Dafniernes rolle som konsument af alger og dermed bidrag til at opretholde en balanceret fødekæde kan derfor kraftigt forringes, hvis der blot kortvarigt (få døgn) findes cypermethrin i vandet.

4.2 Azoxystrobin

4.2.1 Overlevelse

Koncentration-respons
Resultaterne fra koncentration-respons forsøgene viste, at zooplanktonet var mere sensitivt over for azoxystrobin end makroinvertebraterne. Særligt sensitive var E. graciloides med EC₅₀ = 0,038 (0,03 – 0,04) mg l^-1 og laboratoriekulturen af D. galeata med EC₅₀ = 0,095 (0,08 – 0,11) mg l^-1 efter 48 timers eksponering. Disse værdier er op til 14 gange lavere end den fundne EC₅₀ for neonate D. magna på 0,53 (0,48 – 0,57) mg l^-1 efter 48 timers eksponering. I litteraturen opgives den nominelle EC₅₀ for neonate D. magna efter 48 timers eksponering til 0,28 (0,22 – 0,38) mg l^-1 (Miljøstyrelsen, 1994a). Et koncentrationsniveau, der er ca. 2 gange lavere end EC₅₀ for neonate D. magna bestemt i dette projekt, men samtidig et niveau, der er op til 7 gange højere end niveauet for de mest sensitive zooplanktonarter testet i dette projekt. Yderligere skal det bemærkes, at testene på E. graciloides og D. galeata er gjort på individer på ældre udviklingsstadier. Det kan derfor forventes (jf. 4.1.1), at juvenile stadier vil være mere sensitive. Tilsvarende forsøget med cypermethrin var D. magna således heller ikke blandt de mest sensitive arter ved eksponering for azoxystrobin.

Som observeret i koncentration-responsforsøget med cypermethrin var også neonate D. magna eksponeret for azoxystrobin signifikant mere sensitive end voksne ægbærende D. magna med forskelle op til en faktor 3,6. For yderligere diskussion af dette henvises til afsnit 4.1.1.

Hvorfor makroinvertebraterne generelt udviste meget lavere sensitivitet overfor azoxystrobin sammenlignet med zooplankton kan ikke umiddelbart forklares. C. flavicans var ikke påvirket af koncentrationer op til 6 mg l^-1, mens sensitiviteten af C. plumosus var på samme niveau som for neonate D. magna. Det illustrerer, at man skal være varsom med at fastsætte sensitivitetsniveauer for hele organismegrupper.

I koncentration-responsforsøgene blev den laveste NOEC-værdi på 0,034 mg azoxystrobin l^-1 observeret for E. graciloides efter både 24 og 48 timers eksponering. Denne værdi er dog så tæt på EC₅₀, at den reelt ikke kan accepteres som en NOEC-værdi. Kun for 19 % af NOEC-værdierne kunne det forventes, at < 5 % af forsøgspopulationen ville blive immobiliseret.

Azoxystrobinforsøgene viste tilsvarende forsøgene med cypermethrin, at individernes akutte respons var negativt påvirket af eksponeringstiden. Dafniernes sensitivitet var ca. fordoblet efter 48 timer, mens sensitiviteten hos E. graciloides og C. sphaericus, ligesom i forsøget med cypermethrin, ikke blev forøget over de 48 timer. Det vil altså sige, at det er muligt, at E. graciloides og C. sphaericus også ved eksponering for azoxystrobin havde nået effektniveauet for tidsuafhængigt respons allerede efter 24 timers eksponering. Daphnia-arterne kunne der i mod forventes at blive stærkere påvirket af stoffet ved eksponering ud over de 48 timer.

I koncentration-respons forsøgene med ægbærende D. magna og C. plumosus blev der efter 48 timer konstateret iltkoncentrationer omkring 2 mg O₂ l ^-1, uden observation af døde individer i kontrolbehandlingen. Som tidligere beskrevet i afsnit 4.1.1 forventes det ikke at have haft indflydelse på forsøgsresultaterne.

Reproduktion
Reproduktionsforsøgene med azoxystrobin viste en effekt der imidlertid var forskelligt fra cypermethrin, idet azoxystrobin, ved de anvendte koncentrationsgradienter, ikke hæmmede ægdannelsen, men derimod hæmmede den videre udvikling til neonate dafnier. For D. magna’s vedkommende således, at der ikke udvikledes neonate dafnier ved azoxystrobinkoncentrationer over 0,04 mg l^-1 (LOEC 0,08 mg azoxystrobin l^-1). Dette er i overensstemmelse med Miljøstyrelsens referencer, som giver en LOEC på 0,084 mg azoxystrobin l^-1 for D. magna (Miljøstyrelsen, 1994b). Til sammenligning var D. galeata, med en LOEC på 0,03 mg azoxystrobin l^-1 i overensstemmelse med de øvrige resultater i projektet, mere sensitiv end D. magna. Her er det igen værd at nævne, at D. magna var juvenile dyr sammenlignet med de øvrige testorganismer. For D. galeata’s vedkommende var der også effekt på moderdyrenes størrelse ved forsøgsafslutningen. Dyrene, som ikke udviklede neonate dafnier, blev større end forsøgsdyrene ved de lavere azoxystrobinkoncentrationer. Årsagen hertil kan have været, at æggene, som ikke videreudvikledes til levende afkom, blev reabsorberet af moderdyrene i sidste del af forsøgsperioden. Herved blev moderdyrene tilført en energimængde, som formentlig er omsat til øget vækst. Dette fænomen er kendt fra fisk, der forhindres i at gyde, men er hidtil ikke beskrevet for zooplankton.

De to dafnie-arter viste en klar tendens til, at antal individer, som udviklede neonate, faldt med øget eksponeringskoncentration. Dette kunne ikke testes p.g.a. det valgte forsøgs-design, men da begge arter viste samme tendens, er der stærke indicier for, at dafniernes evne til at videreudvikle æg til neonate gradvist hæmmes med øget azoxystrobinkoncentration.

Copepoderne viste et mønster, som lignede mønsteret ved en cypermethrinpåvirkning. Over en given azoxystrobinkoncentration døde copepoderne, inden der blev udviklet æg. Ved en sammenligning af denne parameter med de andre arter var E. graciloides den klart mest sensitive art, LOEC = 0,01 mg azoxystrobin l^-1. Både C. vicinus og E. graciloides viste tendens til reduceret kuldstørrelse med øget azoxystrobin-koncentration. Hos dafnierne var der ingen effekt på kuldstørrelsen. Disse resultater tyder på, at virkningen ikke er den samme hos hhv. dafnier og copepoder, hvilket kan hænge sammen med, at dafnierne bærer æggene under kropsskjoldet, mens copepoderne bærer æggene i en ægsæk fastgjort ved grunden af bagkroppen, hængende under kropfødderne (furca). På denne måde er æggene udsat for en mere direkte påvirkning, end det er tilfældet hos dafnierne.

Cypermethrin viste sig at kunne have effekter på zooplanktonets reproduktionsevne allerede ved 1 % af markdosis (forudsætninger: én procent af normal markdosis rammer hele vandfladen på et 30 cm dybt vandhul, svarende til ca. 0,05 µg cypermethrin l^-1).
Azoxystrobinresultaterne viste, at dette fungicid ligeledes kunne have effekter, om end der krævedes en højere grad af eksponering (ca. 30 % af markdosis). Ved en sådan dosis ville D. galeata være ude af stand til at reproducere sig, og såvel C. vicinus og E. graciloides ville dø inden for 48 timer ved en kontinuert azoxystrobin-påvirkning. Følgevirkningen ville igen være nedsat græsningskapacitet med forringet vandkvalitet til følge.

4.2.2 Adfærd

Fysiologisk respons
Resultaterne af videoregistreringsforsøg med D. magna viste, at aktiviteten af hjerte, brystlemmer og mandibler blev reduceret ved eksponering for azoxystrobin, mens aktiviteten af bagkloen stort set var upåvirket. Brystlemmeaktiviteten var den mest sensitive parameter over for azoxystrobin, men både brystlemmer, hjerte og mandibler blev signifikant påvirket ved 0,5 mg azoxystrobin l^-1 svarende til EC₄ målt som immobilitet for ægbærende D. magna. Bagkloen var kun påvirket efter 24 timers eksponering for 2 mg azoxystrobin l^-1 svarende til EC₂₂ for ægbærende D. magna. Aktiviteten af hjerte, brystlemmer og mandibler er dermed alle sensitive effektkriterier for måling af subletale effekter af azoxystrobin, hvorimod aktiviteten af bagkloen ikke er et egnet effektkriterie.

En reduktion i aktivitet af de målte responsparametre på D. magna var forventet ud fra azoxystrobins virkemekanisme. En blokering af elektrontransporten i cytochrom bc₁ bevirker, at ATP-syntesen hæmmes, og energikrævende processer og funktioner vil gradvist ophøre, hvorefter organismen med tiden dør. De første effekter på aktiviteten af hjertet indtrådte efter 1 times eksponering, mens aktiviteten af brystlemmer og mandibler blev påvirket efter 4-7 timer.

Naturlige strobiluriner og deres syntetiske analoge vides at kunne forflytte hinanden fra bindingsstedet, hvorved bindingen må være reversibel (Clough et al., 1998). Vi observerede dog ingen tegn på restituering hos D. magna, men der i mod kun en gradvis reduktion i aktivitet af de målte responsparametre med tiden.

Tilsvarende cypermethrin vil effekten af eksponering for azoxystrobin potientelt kunne reducere fødeoptagelsen hos D. magna som diskuteret i afsnit 4.1.2 (Fysiologisk respons).

Svømmehastighed
Azoxystrobin har en effekt tilsvarende effekten af cypermethrin på D. magna. Evnen til at foretage en retningsbestemt svømmeaktivitet blev reduceret med ca. 15 % ved en koncentration på 1,0 mg azoxystrobin l^-1. Sammenlignet med effekter omtalt i afsnit 4.2.2. (fysiologisk respons) synes svømmeaktiviteten at være en usensitiv parameter.

Hvis de hidtidige koncentrationsniveauer af azoxystrobin på op til 0,026 µg l^-1 i danske vandhuller (Århus Amt, 2002) er repræsentative, er sandsynligheden for at dette medfører en målbar reduktion i D. magna‘s svømmehastighed lille. Datamaterialet er dog begrænset, og der kan vanskeligt konkluderes om stoffets generelle effekt på svømmeadfærd.

4.3 Bentazon

4.3.1 Overlevelse

Bentazon var meget svagt toksisk over for zooplankton. Stoffet gav kun effekt på få forsøgsindivider ved koncentrationer > 250 mg l^-1, og de beregnede EC₅₀-værdier (3797 mg l^-1 efter 48 timer) skal derfor kun opfattes som et koncentrationsniveau for effekt. Grundet stoffets lave opløselighed i vand (jf. 2.1.3) var det ikke muligt at arbejde med højere koncentrationer og derved få fastlagt EC₅₀ mere præcist. I litteraturen beskrives bentazon ligeledes som svagt toksisk over for akvatiske invertebrater med EC₅₀ > 100 mg l^-1 efter 48 timers eksponering (Miljøstyrelsen, 1994c) og LC₅₀ = 125 mg l^-1 for dafnier (British Crop Council, 1997). I ét forsøg er EC⁵⁰ fundet til 125 mg l^-1 efter 48 timers eksponering, men forfatterne påpeger selv, at resultatet er under indflydelse af en meget lav pH (< 4) i de 2 højeste pesticidkoncentrationer, som var de eneste koncentrationer, hvor der blev observeret maksimal effekt (Miljøstyrelsen, 1994).
På baggrund af bentazons lave toksicitet over for zooplankton blev det prioriteret ikke at fortage yderligere undersøgelser med pesticidet i dette projekt.

Sammenlignet med målte koncentrationer af bentazon i danske søer og vandhuller (jf. 1.2.1) kan der på baggrund af de udførte koncentration-respons forsøg ikke forventes at forekomme nogle alvorlige effekter på zooplankton.

4.4 Samlet vurdering på tværs af stoffer

Ved beskyttelse af limniske økosystemer mod pesticidpåvirkninger må det overvejes, hvilken grad af beskyttelsesniveau der ønskes. Er beskyttelse af ”nøgle”-arter tilstrækkelig, eller skal beskyttelsesniveauet indrettes, således at de mest sensitive organismer i økosystemet også bevares? Problematik-ken forstærkes af, at en art, slægt eller orden ikke nødvendigvis er lige sensitiv over for alle pesticider, og at organismegrupper også rummer relativt ufølsomme repræsentanter (Brock et al., 1992). Eksempelvis viste koncentrations-respons forsøgene, at makroinvertebraterne er en mere sensitiv or-ganismegruppe end zooplankton over for cypermethrin, men ikke over for azoxystrobin, og samtidig var dog 1 art ud af 4 arter af makroinvertebrater meget sensitiv over for azoxystrobin. En rangordning af de enkelte zooplanktonarters sensitivitet udtrykt som EC₅₀ over for både cypermethrin og azoxystrobin viste en rimelig konsistens. Således kan E. graciloides rangordnes som den mest følsomme art efterfulgt af D. galeata (L), D. galeata (F), C. sphaericus, D. magna (neonat) og D. magna (ægbærende) (figur 35). Dette blev understøttet af reproduktionsforsøgene, hvor både D. galeata, C. vicinus og E. graciloides var mere sensitive end D. magna ved en azoxystrobinpåvirkning. For cypermethrins vedkommende var der i repro-duktionsforsøgene ikke væsentlig forskel på zooplanktonets følsomhed.

På baggrund af ovennævnte bør det overvejes om anvendelse af et højt beskyttelseniveau på økosystemniveau kræver identifikation af sensitiviteten af flere arter og organismegrupper over for pesticidstofgrupper eller anvendelse af applikationsfaktorer.

FIGUR 35.
RANGORDNING AF DE ANVENDTE ZOOPLANKTON ORGANISMERS SENSITIVITET OVER FOR AZOXYSTROBIN OG CYPERMETHRIN PÅ BAGGRUND AF EC₅₀ EFTER 24 TIMERS EKSPONERING. (L) = LABORATORIESTAMME, (F) = FELTSTAMME, (24T) = UNGER DER ER 24 TIMER GAMLE, (M. ÆG) = ÆGBÆRENDE DYR.

I godkendelsesproceduren af pesticider fungerer D. magna som standard- testorganisme repræsenterende det 2. trofiske led i den akvatiske græsserfødekæde. I dette projekt med stofferne cypermethrin og azoxystrobin var alle øvrige testede zooplanktonarter (undtagen C. sphaericus i cypermethrinforsøget) imidlertid mere sensitive end D. magna efter både 24 og 48 timers eksponering (målt som EC₅₀). Yderligere skal det pointeres, at test med andre zooplanktonarter end D. magna blev udført på ældre udviklingsstadier af dyrene. Der kan derfor forventes en endnu større sensitivitet af yngre udviklingsstadier blandt disse andre zooplanktonarter.

4.5 Evaluering af de anvendte metoder

Opretholdelse af D. magna og C. sphaericus laboratoriekulturer, som blev anvendt i projektet gennem ca. 2 år, var tidskrævende, men generelt uproblematisk. D. galeata var mere problematisk, da den var sart over for daglig håndtering. Som nævnt i 2.3.3. var det særligt på det neonate stadie, at D. galeata var sart. På trods af håndteringsvanskelighederne var D. galeata en god testorganisme p.g.a. dens relative store følsomhed sammenlignet med de øvrige zooplankton.

Indsamling af forsøgsdyr krævede viden om arternes forekomst, og indledende forsøg omkring arternes overlevelsesevne under standardiserede laboratorieforhold og sårbarhed ved håndtering var nødvendige. En højere kontrolimmobilitet i koncentrations-respons forsøgene blev observeret hos forsøgsdyr fra felten sammenlignet med individer fra laboratoriekulturer. På baggrund af erfaringer opnået i dette projekt kan forsøgsdyr fra naturlige populationer dog anbefales i den videre forskning omkring pesticiders effekt på limniske invertebrater. Forsøg med naturlige populationer afspejler alt andet lige bedre responset i en given lokalitet. Til gengæld må det forventes, at lokale tilpasningsforhold, samt det forhold at konditionen af individer indsamlet i felten vil variere over tid i relation til fx. fødetilgængelighed og temperatur, vil påvirke individernes sensitivitet. Naturlige populationer kan derfor forventes at give større variationer i respons. Men denne variation vil blot give et mere reelt billede af mulige konsekvenser af pesticideksponering under naturlige forhold.

I koncentration-responsforsøgene var brugbarheden af de fastlagte NOEC begrænset, idet koncentrationerne ofte tilsvarede niveauet for en betydelig forventet effekt. Normalt fastlægges NOEC ikke i koncentration-respons-forsøg, idet man ud fra koncentration-respons sammenhængen bestemt ved lineær regression kan estimere sig frem til en koncentration, ved hvilken der kan forventes at forekomme en acceptabel effekt. Det skal dog pointeres, at sikkerheden på EC_x-værdierne falder med stigende afstand fra EC₅₀-værdien (Finney, 1971). Anvendelsen af begge beregningsmetoder illustrerer imidlertid, hvor forskellige niveauer for nul effekt koncentration der kan opnås afhængig af den anvendte metode.

Reproduktionsforsøgene var velegnede til at studere subletale effekter, idet de valgte effektparametre var sensitive ved en pesticidpåvirkning. Både udviklingstiden for ægdannelse og neonate dafnier eller nauplier var anvendelige, men også kuldstørrelsen viste sig anvendelig. Kuldstørrelsen ville dog stå stærkere som parameter, hvis den havde været opgjort på hhv. ikke-udviklede unger (æg) og levende unger. Dette var ikke muligt med den valgte metode. De valgte zooplanktonarter var dog ikke lige velegnede. Eksempelvis var E. graciloides resultaterne ikke umiddelbart sammenlignelige med resultaterne fra de øvrige arter, da den valgte metode betød en kortere eksponeringstid af E. graciloides i forhold til eksponeringstiden af de øvrige arter. I reproduktionsforsøgene valgte vi at betragte det enkelte individ, hvilket muliggjorde at teste for æg og ungers udviklingstid. Vil man teste for procentuel ægudviklingssucces hos de voksne individer, vil det være nødvendigt at fokusere på effekter på grupper af dyr jf. International Standard (1997).

I forsøgene med videoregistrering af D. magna var de undersøgte responsparametre velegnede til påvisning af subletale pesticideffekter. Ved databehandlingen blev det valgt at fokusere på effekter på grupper af dyr frem for på individer. Under naturlige forhold er responsparametrenes aktivitet bl.a. påvirket af fødekoncentration og individstørrelse.
Eksempelvis falder hjerteaktivitet og brystlemmeaktivitet med individstørrelse mens brystlemmeaktivitet stiger med faldende fødekoncentration (Lampert, 1987). På trods af standardiserede forsøgsbetingelser og anvendelse af tilnærmelsesvis ens individer, hvad angår størrelse og reproduktionsstadie samt ved at udføre forsøgene uden fødetilførsel, blev der observeret en signifikant forskel på individerne inden for hver behandlingsgruppe. Derimod var der similaritet mellem behandlingsgrupper, hvor kun hjerte- og brystlemmeaktivitet var signifikant forskellig mellem enkelte grupper i henholdsvis cypermethrin- og azoxystrobinforsøgene. På trods af de individuelle forskelle i aktivitetsniveau viste forsøgsopstillingen sig dog egnet til påvisning af pesticideffekter. For fremtidige studier kan det overvejes at anvende flere individer pr. behandling på bekostning af antal replikerede observationer pr. tidsinterval for derved at reducere variationen mellem individer og samtidig øge teststyrken for forskelle mellem behandlinger.

Generelt kunne det i videoregistreringsforsøgene forventes, at aktiviteten af responsparametrene ville falde gradvist med tiden, fordi dyrene p.g.a. manglen på føde ville blive udmattede. Kontroldyrene ændrede da også aktivitet i løbet af forsøgsperioden, men det var kun til få enkelte tidspunkter at aktiviteten var signifikant forskellig fra startaktiviteten, og der var ikke tendens til hverken en stigning eller et fald i aktivitetsniveauet. Vores erfaring er også, at neonate D. magna kan leve i flere dage uden føde, og vi mener ikke, at den manglende tilsætning af føde har haft nogen nævneværdig indflydelse på resultaterne. Forsøgene blev udført uden fødetilsætning for at undgå adsorption af pesticiderne til fødepartikler og dermed ukontrolleret pesticidoptagelse med føden (Day & Kaushik, 1987c) og reduktion af pesticidkoncentrationen i vandfasen.

Svømmestudierne viste på baggrund af forsøgene med cypermethrin, at svømmeaktiviteten var en følsom og reproducerbar parameter. Den repræsenterer væsentlige fysiologiske mekanismer, og må derfor karakteriseres som et velegnet effektkriterie i toksitetstests.

Sammenholdes de subletale effektstudier var der forskel på sensitiviteten. I de fysiologiske forsøg med D. magna og cypermethrin viste den mest følsomme parameter effekt ved 0,1 µg cypermethrin l^-1. Svømmeforsøgene viste effekt ved 0,05 µg cypermethrin l^-1, mens de mest følsomme reproduktionsforsøg med D. magna viste effekt ved 0,04 µg cypermethrin l^-1. Tilsvarende viste de fysiologiske- og reproduktionsforsøg med D. magna eksponeret for azoxystrobin effekt ved hhv. 0,5 og 0,08 mg azoxystrobin l^-1. Om forskellene skyldes de valgte koncentrationsgradienter kan ikke afgøres.

De fundne LOEC’er for cypermethrin på testede invertebrater var sammenlignelige med tidligere undersøgelser (Stephenson, 1982; Day, 1989). Det skal dog bemærkes at E. graciloides i denne undersøgelse var betydelig mere sensitiv (> 10×) end juvenile D. magna og end ægbærende D. magna (100×). LOEC for de subletale parametre var ligeledes indenfor samme størrelsesorden som LOEC fra tidligere undersøgelser (Day et al., 1987; Day & Kaushik, 1987b).

Dosis-responsforsøg med azoxystrobin er hidtil kun vurderet på D. magna og Macrocyclops fuscus (Miljøstyrelsen, 1994a og Miljøstyrelsen, 1995). Vores undersøgelse viser tilsvarende resultater som de hidtidige for D. magna, hvorimod E. graciloides er ca. en faktor 10-20× mere sensitiv end D. magna. LOEC for de subletale parametre er i vores undersøgelse en faktor 2-3× mere sensitiv (D. galeata) end hidtidige undersøgelser, men altså af samme størrelsesorden. Igen skal nævnes E. graciloides, der som den mest sensitive afveg med en faktor 10 i forhold til de hidtidige LOEC’er.

4.6 Miljørelevans

De opnåede resultater er baseret på nominelle koncentrationer, hvilket betyder, at effektniveauer baseret på aktuelle koncentrationer vil være lavere. I rent vand og med hyppige medieskift må vi dog antage, at forsvindingsraterne grundet nedbrydning og adsorption er mindre end i et naturligt vandhul.

Sammenholdt med målte koncentrationer i danske søer og vandhuller viser projektets koncentration-respons resultater, at bentazon og azoxystrobin ikke kan forventes at give akutte effekter på de testede zooplankton eller makroinvertebrater. Sammenholdt med de registrerede subletale effektkoncentrationer er der heller intet, der tyder på, at der kan forventes subletale effekter på zooplankton. Ved ulovlig omgang med azoxystrobin, fx. ved at en marksprøjte passerer hen over et vandhul eller passerer meget tæt forbi, vil der imidlertid kunne forekomme effekter på dafniernes reproduktionsevne.

For cypermethrins vedkommende kan der i forbindelse med en pesticidpuls forventes akutte effekter på de mest følsomme zooplanktonarter (D. galeata og E. graciloides) og på makroinvertebraterne. Under forudsætning af at cypermethrin i forbindelse med en puls forekommer i koncentrationer som esfenvalerat (0,66 µg l^-1; Århus Amt, 1999), viser projektets subletale effektforsøg, at der kan være effekter på D. magna’s, D. galeata’s og C. vicinus’ reproduktionsevne. Projektet viser også, at der kan være fysiologiske effekter og hermed effekter på fødeoptagelse og svømmeevne hos D. magna.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |