| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

Bilag A
Metodebeskrivelser for bakteriologiske undersøgelser

1.1 Udtagelse og opbevaring af isolater fra Slanetz & Bartley agar

På prøveudtagningstidpunkterne T-4, T-5, T-6 og T-8 blev der udtaget kolonier fra Slanetz & Bartley agar plader med vækst. Der blev udtaget kolonier med forskellig kolonimorfologi. Kolonierne blev opformeret i Brain Heart Infusion Broth (BHIB; Oxoid), og rendyrket på Blod Agar (BA; Oxoid). Isolaterne blev opbevaret i BHIB med 15% glycerol (Sigma) i fryser ved -80C.

1.2 Identifikation og typning af enterokokker ved Polymerase Chain Reaktion (PCR), biokemiske test og Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE)

Identifikation af de rendyrkede isolater blev udført med PCR og biokemiske metoder. Identifikation af enterokokker på slægtsniveau ved PCR udførtes efter metode beskrevet af Ke et al. (1999) og arts bestemmelse efter Dutka-Malen et al. (1995). Bakteriearts bestemmelse af enterokokker ved PCR kunne identificerer E. faecalis, E .faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus og E. flavescens. Se også bilag D.

Der er foretaget biokemisk identifikation efter identifikationsnøgle beskrevet af Manero et Blanch (1999). Se tabel 2.

Enterokokkernes DNA fingeraftryk blev bestemt ved Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) typning, der er en meget diskriminatorisk metode til differentiering af bakterier på DNA niveau. Typning af enterokokker ved PFGE blev udført som beskrevet af Turabelidze et al. (2000).

1.3 Identifikation af enterokokker ved Polymerase Chain Reaction (PCR)

Fremstilling af PCR lysat skete efter at isolater fra -80C fryser var inokuleret på BA og inkuberet i 48 timer ved 37ºC. Kolonimasse svarende til 5 g blev overført til 100 l destilleret H₂O i et eppendorfrør. Efter kogning i 15 min. ved 100C og centrifugering i 3 min. ved 13.000 rpm blev supernatanten med DNA fra cellerne brugt til PCR.

Til PCR anvendtes Ready-To-Go PCR beads (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, N.J.), der indeholder Taq DNA Polymerase, magnesiumklorid (MgCl₂) og deoxyribonukleotid trifosfater (dNTP). Til en PCR-reaktion blev der tilsat 3μl PCR lysat, 1,25 μl af hver primer (koncentration af primer: 10 pmol/l) og destilleret vand til et total volumen på 25μl.

PCR-reaktionen blev udført på en PCR-maskine fra Perkin Elmer .

Efter gennemført PCR-reaktion blev PCR produkterne adskilt ved elektroforese i en 1,5% agarose gel (SeaKem® GTG Agarose, Cambrex Bio Science Rockland, ME USA) i TAE-buffer (89 mM Tris; 89 mM eddikesyre; 2,5 mM EDTA; pH 8) ved 10ºC. Gelen blev derefter farvet i ethidium bromid (2 μg/ml; Sigma, St. Louis, Mo), affarvet i destilleret vand og DNA båndene visualiseret og fotograferet under UV-lys ved Gel Doc 2000 apparat (Bio Rad, Sverige). En 100-bp DNA ladder ("stige") (Gibco-BRL) blev påsat hver agarose gel som størrelsesmarkør.

1.4 Bestemmelse af enterokokslægt

Der blev anvendt slægt-specifikke primerer for enterokokker med følgende sekvens:

• Ent1 (5'-TACTGACAAACCATTCATGATG-3') og
• Ent2 (5'-AACTTCGTCACCAACGCGAAC-3')

Primerne blev syntetiseret hos firmaet TAG Copenhagen (København, Danmark). Disse primere giver et PCR-produkt med en størrelse på 112 bp.

PCR program til disse primere inkluderede denaturering i 5 min ved 94ºC i første cykel, derefter 94ºC i 20 sek., 55ºC i 30 sek. og 72ºC i 30 sek. i de næste 35 cykler, hvorefter programmet blev afsluttet med 10 min. ved 72ºC. PCR rørene blev derefter afkølet til 4ºC og opbevaret i fryser ved –20ºC.

1.5 Bestemmelse af enterokokart

Enterokokarten blev bestemt ved såkaldt multiplex PCR-reaktion med 4 primersæt. Ved en multiplex PCR kan der anvendes flere primersæt på en gang og der kan således testes for flere arter på én gang.

Primere for detektion af E. faecalis havde sekvenserne:

• E1 (5'-ATCAAGTACAGTTAGTCTT-3') og
• E2 (5'-ACGATTCAAAGCTAACTG-3')

Primere for detektion af E. faecium havde sekvenserne:

• F1 (5'-GCAAGGCTTCTTAGAGA-3') og
• F2 (5'-CATCGTGTAAGCTAACTTC-3')

Primere for detection af E. gallinarum havde sekvenserne:

• vanC1 F (5'-GGTATCAAGGAAACCTC-3') og
• vanC1 B (5'-CGAGCAAGACCTTTAAG-3').

Et enkelt primersæt blev anvendt til detektion af såvel E. flavescens og E. casseliflavus da disse to arter nu betragtes som én art (Teixeira et al., 1997):

• vanC23 F (5'-CTCCTACGATTCTCTTG-3') og
• van C23 B (5'-CGAGCAAGACCTTTAAG-3').

PCR-reaktion med primerne E1 og E2 giver et PCR-produkt på 941 bp; primerene F1 og F2 et produkt på 550 bp; primerne vanC1 F og vanC1 B et produkt på 822 bp; endelig gav primerene vanC23 f og van C23 B et PCR-produkt på 439 bp. Det var muligt at anvende alle de nævnte primere i samme PCR reaktion, da de forskellige størrelser af produkterne muliggør en adskillelse i den efterfølgende elektroforese.

PCR programmet for multiplex reaktionen var denaturering i 5 min ved 94ºC i første cykel, derefter 94ºC i 1 min., 54ºC i 1 min. og 72ºC i 2 min. i de næste 35 cykler, hvorefter programmet blev afsluttet med 10 min. ved 72ºC. PCR rørene blev afkølet til½ 4ºC og opbevaret i fryser ved –20ºC.

Tabel 1 Identifikationsnøgle til bakterieslægt og artsbestemmelse af enterokokker ved Polymerase Chain Reaktion (PCR)

1.6 Biokemisk identifikation af enterokokker

En forudsætning for at benytte identifikationsnøglen beskrevet af Manero et Blanch (1999), er at bakterieisolaternes slægt først bestemmes. Enterokokslægt blev fastlagt med PCR med de slægtsspecifikke primere Ent1 og Ent2.

Kulhydratfermentering blev udført i basal mediet Sukkerfri Bouillon, der pr liter indeholder 10 g kødekstrakt (Merck), 10 g pepton (Difco), 3 g natriumklorid (NaCl; Merck), 2 g di-natriumhydrogenphosphat-dodecahydrat (Na₂HPO₄, 12H₂O; Merck), 12 ml 0,2% bromthymolblåt (Merck). Bouillonen steriliseres ved autoklavering og pH indstilles til 7,4 med 0,1 N natriumhydroxid (NaOH; Merck). L(+) arabinose, L(-) sorbose, D(-) ribose, methyl-α-D-glucopyranoside og mannitol blev tilsat i en koncentration på 1% i sukkerfri bouillon. Dette blev opnået ved at opløse 2 g af hver sukkerart i 10 ml destilleret vand, sterilfiltrere dette og tilsætte det til 190 ml sukkerfri bouillon. Der overførtes 4 ml af hver sukkerartsbouillon til sterile rør, som blev inokuleret med 4-5 kolonier af det rendyrkede bakterieisolat. Den inokulerede bouillon blev inkuberes ved 37ºC i varmeskab og aflæst efter 24 og 48 timer. Et testresultat var positivt, når bouillonen var gul.

Pyrrolidonyl aminopeptidase og α-galactosidase aktivitet blev evalueret med diagnostiske kit fra Rosco Diagnostica (Tåstrup, Danmark). Testen udførtes som beskrevet af producenten og inkubation foregik ved 37ºC i varmeskab med aflæsning efter 4 timer.

Arginin dihydrolase testen udførtes i arginin bouillon bestående af 5 g tryptose (Difco), 5 g gærekstrakt (Oxoid), 2 g kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO_4; Merck), 0,5 g glukose (Merck) og 3 g arginin (Merck) pr. liter. Bouillonen blev steriliseret ved autoklavering og pH indstilt til 7,0 med 0,1 N natriumhydroxid (NaOH; Merck). Arginin bouillonen blev hældt i rør med 4 ml i hver og inokuleret med 4-5 kolonier af det rendyrkede bakterieisolat. Denne test blev udført ved 37ºC med aflæsning efter 48 timer ved tildrypning af phenolrødtindikator. Reaktionen blev aflæst som positiv, når der fandtes farveomskift til rød.

Produktionen af gul pigment blev evalueret ved inokulering af isolaterne på Brain Heart Infusion Agar (BHIA; Oxoid), som blev inkuberet ved 37ºC i 24-48 timer. Et isolat producerede pigment når kolonimassen havde en klar gul farve.

Testene er udført enkeltvis i henhold til identifikationsnøglen i tabel 2 beskrevet af Manero et Blanch (1999). De 10 kontrolstammer vist i tabel 2 blev medtaget i alle testene.

Tabel 2 Identifikationsnøgle til biokemisk bakterieslægtsbestemmelse af enterokokker
(PYRase = pyrrolidonyl aminopeptidase)

1.7 Typning af enterokokker ved Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE)

Typning af de isolerede enterokokker ved PFGE blev udført efter metode beskrevet af Turabelidze et al. (2000).

Enterokokisolaterne blev opformeret i BHIB på ryst i 48 timer ved 37ºC. Bakteriecellerne blev vasket og centrifugeret i TE 100:100 (100 mM Tris base (Merck), 100 mM EDTA (Merck)) og genopslemmet i 0,5 ml TE 100:100. Absorbansen måltes derefter ved 595 nm på spektrofotometer (Labsystems Multiskan RC). Cellesuspentionen blev fortyndet så absorbansen lå mellem 0,9 og 1,0 svarende til en bakteriekoncentration på 2,5-310⁹ cfu/ml.

Til lysering af bakteriecellevæggen anvendtes 0,2 ml cellesuspention, der blandtes med 0,2 ml lysisbuffer (50mM Tris, 50mM EDTA, mutanolysin (1250 U/ml; Sigma), lysozyme (2,5 mg/ml; Sigma) og proteinase K (1,5 mg/ml; Roche); pH 8) og blev inkuberet ved 37ºC i 10 minutter. Derefter blev der tilsat 0,4 ml 1,2% agarose (SeaKem® Gold Agarose, Cambrex) indeholdende 1% SDS (natrium lauryl sulfat, Merck). Dette blandtes forsigtigt inden overførsel til støbeforme (Bio-Rad, Sverige), hvor der blev fremstilles 4-6 blokke af agarose med DNA fra bakterien. Blokkene blev derefter inkuberet i ESP-buffer (0,5 M EDTA, 1% sarcosyl (Sigma), proteinase K (400 μg/ml)) for nedbrydning af proteiner i 2 timer ved 55ºC. Efter dette blev blokkene vasket ved 50ºC, først i destilleret vand og så i TE 10:1 (10 mM Tris, 1 mM EDTA).

Til elektroforese anvendtes 1/8 af en blok, der blev skåret af med en skalpel og overført til et eppendorfrør med buffer og restriktionsenzymet Sma I (30 Unit; New England Biolabs, MA). Denne opløsning blev inkuberet i 2 timer ved 30ºC. Der blev fremstillet en 0,8% agarose gel (SeaKem® Gold Agarose) med 30 brønde, hvor der i hver brønd er plads til en afskåret blok. Elektroforese karret blev fyldt med 2,5 liter 0,5xTBE-buffer (1xTBE buffer er 89mM Tris, 90mM borsyre, 2,5 mM EDTA). De skårne blokke blev påsat agarose gelen og brøndene lukkedes efterfølgende med 1,2% agarose (SeaKem®® Gold Agarose). Der blev desuden påsat en PFGE størrelsesmarkør (New England Biolabs) på hver gel. Der blev anvendt en CHEF DRIII apparat (Bio-Rad, Sverige) til elektroforese.

Elektroforese forholdene var følgende:

efter ialt 20 timers elektroforese kørsel blev gelen farvet i ethidium bromid (2 μg/ml; Sigma, St. Louis, Mo), derfter affarvet i destilleret vand, og endelig blev DNA båndene visualiseret og fotograferet under UV-lys ved Gel Doc 2000 (Bio Rad, Sverige).

1.8 Kimtal ved 37ºC

Kimtal ved 37ºC blev bestemt ved tælling af kolonier på Water Plate Count Agar (WPCA) (Oxoid, Hampshire, England) efter inkubering ved 37ºC i 44 4 timer (DS/EN ISO 6222, 2000). Detektionsgrænsen for undersøgelsen var 10 bakterier pr. ml. Urinprøverne (1 ml) blev udtaget sterilt fra glasflaskerne og fortyndet ved 10-folds fortyndinger.

Der blev ikke foretaget nogen videre typning af isolater fra mulig eftervækst sidst i forsøgsperioden, idet kimtal ved 37ºC må forventes at repræsente en meget heterogen bakterioflora. Ud fra projektets begrænsede tidsmæssige og økonomiske ressourcer blev det derfor besluttet at karakterisere og type enterokokisolater fra Slanetz & Bartley agar, idet enterokokker er en vigtigere fækal indikator end kimtal ved 37ºC.

1.9 Suspekte termotolerante coliforme bakterier

Suspekte termotolerante coliforme bakterier blev bestemt ved tælling af typiske gule kolonier på membran lauryl sulfat agar efter inkubering ved 44ºC i 18-24 timer (Mod ISO/DIS 9308-1, 1998). Detektionsgrænsen for undersøgelsen var 10 bakterier per ml. Urinprøverne (1 ml) blev udtaget sterilt fra kapslerne og fortyndet ved 10-folds fortyndinger.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Januar 2004, © Miljøstyrelsen.