| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

Bilag B
Oprensning og detektion af oocyster i musetarmsæt

1. Hud og bugvæg åbnes forsigtigt. Mavesækken lokaliseres (hvid da den er fyldt med mælk). Duodenum frigøres forsigtigt fra mavesækken ved hjælp af en pincet, milten fjernes og tarmsættes løsnes fra krøset indtil rectum. Så meget som muligt af rectum medtages idet hele tarmsættet udtages.
2. Tarmsættet placeres i ca. 20 ml kold PBS-Tween 20 i en plast eller glasbeholder og findeles med en saks
3. Der tilsættes yderligere 30 ml og de i alt 50 ml hældes i en lille stomacherpose hvorefter der mixes godt i ca. 1 minut
4. De 50 ml filtreres igennem en lille plastsigte (apertur= ) ned i et 50 ml centrifugerør.
5. Prøverne centrifugeres nu 10 minutter ved 1540 G/ rpm (hurtig accelleration, medium break) og der suges derefter ned til 5 ml. Vortex IKKE!!
6. Prøverne overføres til 15 ml centrifugerør, idet pellet overføres forsigtigt. 50 ml røret vaskes med MQ-vand indtil 15 ml røret er fuldt.
7. Prøverne centrifugeres 10 minutter ved 1540 G/ rpm (hurtig accelleration, medium break) og der suges derefter ned til 1 ml.
8. Vortex for at resuspendere pellet. Der udtages 60 μl som fordeles på 3 brønde af et objektglas.
9. Prøverne tørrer ved stuetemperatur, evt. natten over.
10. Der tilsættes 50 μl methanol per brønd for at fiksere prøverne. Disse luftørrer 15-20 minutter i stinkskab.
11. Der tilsættes 40 μl FITC-antistof mod Crypto og der inkuberes i et fugtighedskammer i mørke i 1 time.
12. Brøndene vaskes forsigtigt 2 gange med 100 l MQ-vand og der tilsættes derefter en dråbe IFA mounting fluid til hver og et dækglas lægges på.
13. Antal oocyster tælles i alle brønde ved 400x forstørrelse.

Specielle materialer:
PBS-Tween 20 : PBS indeholdende 0,02% Tween-20
FITC-antistof
IFA mounting fluid

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Januar 2004, © Miljøstyrelsen.