| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

3 Resultater – Projekt 1 Bakteriologi

3.1 Fysisk-kemiske målinger

3.1.1 Temperatur

Temperaturen i de benyttede inkubatorer blev målt 2 gange ugentligt. I løbet af forsøgsperioden varierede temperaturen i inkubatorerne maksimalt med ±1ºC.

3.1.2 pH

Resultaterne af pH-målinger i urinflaskerne er vist i figur 4, 5 og 6 nedenfor. pH var i alle urinprøverne mellem 8,5 og 9,1 ved starten af forsøget, dog højest i urin fra Lokalitet 3 og 4, hvor tilblanding af vand og dermed fortynding af urinen havde været mindst. De målte pH-værdier var relativt stabile i løbet af den 6 måneder lange undersøgelsesperiode, med det største pH-fald på ca. 0,5 i urin fra Lokalitet 1 (figur 4). Et fald i pH-værdierne skyldes med stor sandsynlighed et udslip af NH₃ (ammoniak) dampe ved åbning af flaskerne for hver prøveudtagning. Dette udslip har dog været meget begrænset jf. de lave reduktioner i de målte pH-værdier. Betegnelsenre "lukket" og "åben" i de efterfølgende figurer henviser til om urinopsamlingstankene, hvorfra urinen blev indsamlet, var aflukket for urintilførsel ("lukket") eller om der blev tilført urin på indsamlingstidspunktet ("åben"). Det skal bemærkes, at der for hver undersøgt temperatur blev udført dobbeltbestemmelser ved analyser af urinprøver fra to forskellige beholdere.

Figur 4 Ændringer i pH i lagret urin fra Lokalitet 1, tank 2 (lukket) og tank 4 (åben).

Klik her for at se Figur 4

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer.

Figur 5 Ændringer i pH i lagret urin fra Lokalitet 2 tank 3 (lukket) og tank 4 (åben).

Klik her for at se Figur 5

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer.

Figur 6. Ændringer i pH i lagret urin fra Lokalitet 3 (HFB) og Lokalitet 4 (HFT).

Klik her for at se Figur 6

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer.

3.1.3 Ammoniumkoncentration

Resultaterne af ammonium-målinger er vist i figur 7, 8 og 9 nedenfor. Som forventet var ammoniumkoncentrationen højest i urin fra Lokalitet 3 og 4 hvor tilblanding af vand og dermed fortynding af urinen havde været mindst. De målte ammonium-koncentrationer var relativt stabile (ca. 8 ppm for urin fra åben tank og 16-17 ppm for urin fra lukket tank) i løbet af de 6 måneder, med undtagelse af en generel stigning ved T-4 ved alle lokaliteter. Denne stigning kunne skyldes en metodisk fejl ved udtagning af prøverne, da den er af samme størrelse for alle lokaliteter ved netop T-4.

Figur 7 Ammoniumkoncentration (ppm – parts per million) ved Lokalitet 1

Klik her for at se Figur 7

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer

Figur 8 Ammoniumkoncentration (ppm) ved Lokalitet 2

Klik her for at se Figur 8

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer

Figur 9 Ammoniumkoncentration (ppm) ved Lokalitet 3 (HFB) og 4 (HFT)

Klik her for at se Figur 9

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer

3.1.4 Sammenhæng mellem pH og ammoniumkoncentration

Der var generelt god overensstemmelse mellem pH og ammonium værdierne idet de højeste pH-værdier blev målt ved Lokalitet 3 og 4, som også havde de højeste koncentrationer af ammonium. Ligeledes blev de laveste pH-værdier målt ved Lokalitet 1, hvor ammonium-koncentrationen også var lavest.

Med udganspunkt i de begrænsede variationer i pH og ammoniumkoncentration igennem forsøgsperioden skønnes det ikke at variationer de to parametre medførte en signifikant påvirkning af overlevelsen af testparametrene.

3.2 Bakteriologiske målinger

3.2.1 Enterokokker

Resultaterne af undersøgelserne for enterokokker i lagret urin fra de tre lokaliteter er vist i figur 10, 11 og 12. Det skal bemærkes, at der for hver undersøgt temperatur blev udført dobbeltbestemmelser ved analyser af urinprøver fra to forskellige beholdere.

Som forventet fandtes den højeste startkoncentration af enterokokker i urin fra de åbne tanke, som blev tilledt urin ved prøveindsamlingstidspunktet. Der er således sket en fækal forurening af urinen, som mest sandsynlig skyldes en ikke 100 % separation af urin og fæces. Årsagerne hertil kan være flere, eksempelvis fækal forurening af urin fra personer med diarré eller fra børn som oftest har sværere ved at bruge urinseparerende toiletter korrekt sammenlignet med voksne.

Startkoncentration af enterokokker var 1 log-enhed lavere i urin fra Lokalitet 3 og 4. Dette kan skyldes, at denne urin havde mindre vandtilførsel ved toiletskyl og at den koncentrede urin havde en relativt øget reducerende effekt på enterokokantallet.

Figur 10 Reduktion i antal enterokokker i lagret urin fra Lokalitet 1 ved 3 forskellige temperaturer.

Klik her for at se Figur 10

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer.

I urin fra Lokalitet 1 (figur 10) skete der en 2-3 log reduktion i antallet af enterokokker ved alle tre lagringstemperaturer. Detektionsgrænsen på 1 cfu/ml blev nået hurtigst (efter en måned) for urin fra lukket tank, lagret ved 20ºC. Den langsomste reduktion af antal enterokokker skete i urin fra åben tank, lagret ved 4ºC. Her blev detektionsgrænsen først nået efter fem måneders lagring, hvorefter der blev observeret en svag stigning i antal enterokokker ved prøveanalyse efter seks måneders lagring. Dette fund indikerer en mulig eftervækst ved 4ºC. Der blev udtaget et antal enterokokisolater repræsenterende forskellige kolonityper til videre karakterisering, identifikation og typning. Resultaterne af disse undersøgelser er beskrevet i de efterfølgende afsnit (3.2.1.1).

Figur 11 Reduktion i antal enterokokker i lagret urin fra Lokalitet 2 ved 3 forskellige temperaturer.

Klik her for at se Figur 11

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer.

I urin fra Lokalitet 2 (figur 11) skete der en 1-3 log reduktion i antal enterokokker ved alle tre lagringstemperaturer i løbet af forsøgsperioden. Detektionsgrænsen på 1 cfu/ml blev nået hurtigst for urin fra lukket tank, lagret ved 4, 10 og 20ºC, samt for urin fra åben tank, lagret ved 20ºC. Dette skete efter 1-2 måneders lagring. Den langsomste reduktion i antal enterokokker skete i urin fra åben tank, lagret ved 4 og 10ºC. Her blev detektionsgrænsen nået efter 4-5 måneders lagring, hvorefter der blev observeret en tilsyneladende svag stigning i antallet efter 5 og 6 måneders lagring for urin fra åben tank, lagret ved 4, 10 og 20ºC, samt en midlertidig stigning i antallet i urin fra lukket tank, lagret ved 4ºC. Denne stigning fandtes at være statistisk signifikant (p<0.05) og tyder på en mulig eftervækst ved flere temperaturer. Der blev udtaget et antal enterokokisolater repræsenterende forskellige kolonityper til videre identifikationsbestemmelse. Resultaterne af disse undersøgelser er beskrevet i de efterfølgende afsnit.

Figur 12 Reduktion i antal enterokokker i lagret urin fra Lokalitet 1 (HFB) og 2 (HFT) ved 3 forskellige temperaturer.

Klik her for at se Figur 12

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de respektive temperaturer.

I urin fra Lokalitet 3 og 4 (figur 12) skete der en 1-2 log reduktion i enterokokker ved alle tre lagringstemperaturer i løbet af lagringsperioden. Detektionsgrænsen på 1 cfu/ml blev nået allerede efter 1 måneds lagring ved alle tre temperaturer. Der fandtes ingen eftervækst af enterokokker.

3.2.1.1 Biokemisk og PCR karakterisering af enterokokisolater

Der blev udtaget kolonier fra Slanetz & Bartley agar på prøveudtagningstidspunkterne T-4, T-5, T-6 og T-8 fra Lokalitet 1 og 2. Fra Lokalitet 3 og 4 fandtes ingen vækst af kolonier på Slanetz & Bartley agar efter T1. Ofte fandtes der kun en enkelt eller få kolonier på agarpladerne.

Resultaterne af den biokemiske karakterisering og PCR bestemmelse af enterokokslægt og art af de ialt 34 udvalgte isolater fra Lokalitet 1 og 2 er vist i tabel 8. Resultaterne af multiplex PCR bestemmelserne er vist i figur 13, hvor DNA båndene for teststammerne er vist sammen med båndene for en række enterokok kontrolstammer. Teststammer og kontrolstammer med samme DNA båndstørrelse tilhører samme art.

Isolater kunne kun vokse efter udsæd af urinprøver fra den åbne tank ved Lokalitet 1. Alle 11 isolater blev bestemt til E. faecium. Ved T-4 blev E. faecium isoleret fra urinflasker opbevaret ved såvel 4 og 10ºC; ved T-5 blev der kun isoleret et enkelt E. faecium isolat fra urinflaske opbevaret ved 20ºC; og ved T-6 og T-8 blev E. faecium kun isoleret ved 4ºC. Ved T-4 blev der isoleret et enkelt E. mundtii isolat (tabel 8). Alle E. faecium isolater havde samme kolonitype på Slanetz & Bartley agar med rødbrunt centrum og lyserød randzone og en diameterstørrelse på 1-2 mm.

Ialt 22 isolater blev udvalgt til videre karakterisering og typebestemmelse fra prøver fra åben og lukket urintanke ved Lokalitet 2 (tabel 8). Ved T-4 blev 4/5 isolater fra urinprøver opbevaret ved 4 og 10ºC fra den åbne urintank bestemt som E. faecium og et enkelt isolat som E. hirae. Ved T-5 blev 7/8 isolater fra urinflasker opbevaret ved 4 og 20ºC bestemt som E. gallinarum og kun et enkelt isolat som E. faecium. Ved T-6 blev der i urin fra åbne urintanke isoleret E. gallinarum og E. faecium ved såvel 4 og 10ºC. Endelig blev der ved T-8 isoleret E. gallinarum og E. faecium ved 4ºC (tabel 8). Der blev kun ved T-5 isoleret kolonier fra prøver fra lukket urintank. Alle E. gallinarum havde samme kolonitype på Slanetz & Bartley agar med rødbrun farve og en diameterstørrelse på ca. 1 mm.

Der var overensstemmelse mellem resultaterne af den biokemiske karakterisering og PCR bestemmelse af slægt og art.

Tabel 8 Resultater af biokemisk karakterisering og PCR for slægts- og artsbestemmelse af enterokokisolater fra Slanetz & Bartley agar

a , C: centrum af koloni; R: randzone af koloni

3.2.1.2 PFGE typning af enterokokker (DNA fingeraftryk)

Resultaterne af PFGE typningen af enterokokker er vist i tabellerne 9 og 10, ligesom eksempler på PFGE typningen er vist for E. faecium i figur 14 og for E. gallinarum, E. mundtii, og E. hirae i figur 15. Ved sammenligning af PFGE DNA båndtyper vil bakterioisolater med identisk antal og båndstørrelser ofte være af klonal oprindelse, eksempelvis som følge af opformering/eftervækst. Isolater med få bånds forskelle vil ofte også være identiske eller nært beslægtede. Forskelle i båndmønstre skyldes forskelligheder i DNA sekvenser og dermed i genkendelsessteder for det anvendte skæringsenzym SmaI.

Tabel 9 Resultater fra PFGE typning af E. faecium

Ved PFGE typning af E. faecium isolater fra Lokalitet 1 fandtes to PFGE typer, A og B, hvor 10/11 isolater havde type A (tabel 9). PFGE type A isolater blev kun fundet i urin fra den åbne tank og ved alle tre undersøgte temperaturer. Type A og B har samme grundmønster, men type B indeholder yderligere 7 DNA bånd af forskellig størrelse (figur 14). Fundet af E. faecium med identisk PFGE type A indikerer at disse isolateret er tæt beslæget, eksempelvis kan isolaterne stamme fra samme person og/eller de er klonalt relateret som følge af multiplikation. Det ser således ud til at en identisk E. faecium stamme udviste øget overlevelse og/eller evne til multiplikation i urinflaskerne ved de tre temperaturer.

Tabel 10 Resultater fra PFGE typning af E. gallinarum

I urin fra Lokalitet 2 blev der identificeret både E. faecium og E. gallinarum. Derudover blev E. hirae identificeret en gang ved T-4 fra en åben tank.

De 9 E. faecium isolater havde ialt tre forskellige PFGE typer C, D og E (tabel 9). PFGE type C blev fundet i urin fra en lukket tank som blev opbevaret ved 4ºC. Denne PFGE type fandtes også hos et enkelt isolat fra urin opbevaret ved 4ºC og hos tre isolater opbevaret ved 10ºC. Et isolat isoleret fra en åben tank ved 4ºC havde type D, mens PFGE type E kun blev set hos tre isolater fundet i åbne tanke og opbevaret ved 4ºC. Med fundet af tre forskellige PFGE typer, syntes der således at forekomme flere forskellige E. faecium stammer som udviste øget overlevelse og/eller evne til multiplikation i den åbne urintank ved Lokalitet 2.

Figur 13 Multiplex PCR analyse af udvalgte enterokokisolater, samt 10 kontrolstammer.

Bane A, 100 bp DNA størrelsesmarkør; Bane B, Urin-1; Bane C, Urin-2; Bane D, Urin-3; Bane E, Urin-4; Bane F, Urin-5; Bane G, Urin-6; Bane H, Urin-7; Bane I, Urin-14; Bane J, Urin-15; Bane K, Urin-17; Bane L, Urin-18; Bane M, Urin-19; Bane N, Urin-20; Bane O, Mix kontrol; Bane P, E. faecium 301; Bane Q, E. faecalis 302; Bane R, E. gallinarum CECT 970; Bane S, E. flavescens CECT 4481; Bane T, E. avium CECT 968; Bane U, E. raffinosus NCTC 12192; Bane V, E. mundtii ATCC 43186; Bane W, E. hirae 9790RF; Bane X, E. dispar CECT 4310; Bane Y, E. durans CCUG 7972; Bane Z, 100 bp DNA størrelsesmarkør.

I urin fra Lokalitet 2 havde alle 12 E. gallinarum stammer, som var isoleret fra såvel åben og lukket tank ved de tre undersøgte temperaturer, identisk PFGE type F (figur 15). Det ser således ud til at en identisk E. gallinarum stamme udviste øget overlevelse og/eller evne til multiplikation i urinflaskerne ved de tre temperaturer.

Figur 14 PFGE typer af E. faecium med DNA skåret med skæringsenzymet SmaI.

Bane A, Low-range PFGE markør; Bane B, Urin-2; Bane C, Urin-3; Bane D, Urin-29; Bane E, Urin-4; Bane F, Urin-5; Bane G, Urin-6; Bane H, Urin-30; Bane I, Urin-9; Bane J, Urin-10; Bane K, Urin-11; Bane L, Urin-23; Bane M, Urin-16; Bane N, Urin-7; Bane O, Urin-24; Bane P, Urin-25; Bane Q, Urin-31; Bane R, Urin-8; Bane S, Urin-12; Bane T, Urin-13; Bane U, Urin-27; Bane V, Low-range PFGE markør.

Forskellen i DNA båndmønstre mellem PFGE typerne fundet hos E. faecium og E. gallinarum var stor. Generelt havde PFGE typen for E. gallinarum mindre fragmenter med det største fragment på ca. 5,5 kb, mens båndmønstre hos E. faecium havde en del større fragmenter. Det var således muligt at differentiere mellem de to arter baseret på deres PFGE type. For E. faecium, E. mundtii og E. hirae var størrelsen og fordelingen af DNA fragmenterne mere jævn og adskilte ikke disse arter tydeligt.

Figur 15 PFGE typer af E. gallinarum samt E. mundtii og E. hirae med DNA skåret med skæringsenzymet SmaI.

Bane A, Low-range PFGE markør; Bane B, Urin-15; Bane C, Urin-17; Bane D, Urin-18; Bane E, Urin-32; Bane F, Urin-33; Bane G, Urin-34; Bane H, Urin-19; Bane I, Urin-20; Bane J, Urin-26; Bane K, Urin-21; Bane L, Urin-22; Bane M, Low-range PFGE markør; Bane N, Urin-1; Bane O, Urin-14; Bane P, Low-range PFGE markør.

3.2.1.3 Kimtal ved 37ºC

Resultaterne af undersøgelserne for kimtal ved 37ºC i urinprøver fra de fire lokaliteter er vist i figur 16, 17 og 18. Der skal bemærkes, at der for hver undersøgt temperatur blev udført dobbeltbestemmelser ved analyser af urinprøver fra to forskellige beholdere.

Urin fra åbne tanke havde samme antal eller svagt højere antal kim ved T-0 sammenlignet med urin indsamlet fra lukkede tanke. Startkoncentration af kim ved 37ºC var som for enterokokker ca. 1 log-enhed lavere i urin indsamlet fra Lokalitet 3 og 4 sammenlignet med urin fra Lokalitet 1 og 2.

Figur 16. Reduktion i antal kim ved 37ºC i lagret urin fra lokalitet 1 ved 3 forskellige temperaturer.

Klik her for at se Figur 16

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de angivne temperaturer.

I urin fra Lokalitet 1 skete der generelt en begrænset nettoreduktion i kimtal ved 37ºC i løbet af lagringsperioden (figur 16). I urin fra lukket tank, lagret ved 4 og 10ºC, skete der en 1-2 log-enheders reduktion i kimtallet i løbet af 6 måneders lagring. I urin fra lukket tank, lagret ved 20ºC, skete der ingen kimtalsreduktion, men derimod tilsyneladende en svag stigning i kimtallet i løbet af de 6 måneder. Resultaterne tyder på, at bakteriekim selv efter 6 måneders lagring af urin kan udvise vækst, især ved opbevaring af urinen ved 20ºC.

I urin fra åben tank, lagret ved 4 og 10ºC, skete der en gradvis reduktion i kimtal på i alt 2-3 log-enheder i løbet af de 6 måneders lagring. Det skal bemærkes, at selvom der i urin fra åben tank, lagret ved 20ºC, skete en reduktion på 2-3 log-enheder i kimtallet i den ene urinflaske (replikat 1), fandtes der i den anden flaske (replikat 2) en kimtalsstigning på 1 log-enhed fra T-5 til T-6.

Figur 17 Reduktion i kimtal ved 37ºC i lagret urin indsamlet fra Lokalitet 2, ved 3 forskellige temperaturer.

Klik her for at se Figur 17

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de angivne temperaturer.

I urin fra Lokalitet 2 skete der ligeledes generelt en begrænset reduktion i kimtal ved 37ºC i løbet af lagringsperioden (figur 17). I urin fra lukket tank, lagret ved 4, 10 og 20ºC, skete der en ringe eller ingen kimtalsreduktion i løbet af de 6 måneders lagring. I urin fra åben tank, lagret ved 20ºC, skete der en reduktion i kimtallet på 3 log-enheder i løbet af de 6 måneder, hvorimod der fandtes en 1-2 log-enheds kimtalsreduktion ved de to lavere temperaturer. Der var ingen tegn på en stigning i kimtallet i urin indsamlet fra Lokalitet 2.

Figur 18 Reduktion i antal kimtal ved 37ºC i lagret urin fra Lokalitet 3 og 4 ved 3 forskellige temperaturer

Klik her for at se Figur 18

T-0 til T-6 angiver antal måneders lagring ved de angivne temperaturer.

I urin fra Lokalitet 3 og 4 var der som udgangspunkt en lidt lavere koncentration af kim efter dyrkning ved 37ºC (figur 18) sammenlignet med kimtallene i urin fra de to førnævnte lokaliteter.

I løbet af de 6 måneders lagring skete der ingen eller kun ringe kimtalsreduktion ved alle tre undersøgte lagringstemperaturer. Der fandtes således ingen stigning i kimtallet i urin fra Lokalitet 3 og 4.

3.2.2 Suspekte termotolerante coliforme

Resultaterne for undersøgelserne for suspekte termotolerante coliforme bakterier er vist i Bilag C.

Generelt fandtes der lave startkoncentrationer af suspekte termotolerante coliforme bakterier i urin fra alle lokaliteterne, ligesom der kun kunne påvises suspekte termotolerante coliforme i åbne tanke fra Lokalitet 1 og 2. De lave koncentrationer af denne parameter tyder på en lavgradig frisk fækal forurening og/eller en ringe overlevelse af suspekte termotolerante coliforme bakterier i lagret urin. Der fandtes således ikke suspekte termotolerante coliforme i de tanke der havde været aflukkede i cirka 1 måned.

Resultaterne viser, at sammenlignet med enterokokker overlever termotolerante coliforme bakterier kun kort tid i lagret urin.

3.3 Delkonklusioner – Projekt 1 Bakteriologi

• Anvendelsen af 2-liters flasker til lagringsforsøg med urin medførte ringe pH variation (8,5-9,1) med de højeste værdier i urin fra urinopsamlingstanke med mindst vandtilførsel
• Enterokokker kunne isoleres i urin indsamlet fra alle opsamlingstanke (T-0)
• Reduktionen i antallet af enterokokker udviste store variationer, dog med størst reduktion i urin fra lukkede tanke som blev opbevaret ved høje temperaturer
• I urinprøver fra Lokalitet 1 og 2 blev der efter 5-6 måneders lagring observeret en svag stigning i antal enterokokker efter lagring ved 4, 10 og 20ºC. Dette tyder på en øget overlevelse og/eller evne til multiplikation af enterokokker ved langvarig lagring af urin ved flere temperaturer
• Der blev udvalgt 34 bakterieisolater fra Slanetz & Bartley agarplader, som ved biokemisk karakterisering og PCR blev identificeret som tilhørende slægten Enterococcus
• Langt hovedparten af testede isolater fra Lokalitet 1 var E. faecium, som havde identisk PFGE type A. Dette indikerer, at disse isolater er tæt beslæget, eksempelvis kan de stamme fra samme person og/eller de er klonalt relateret som følge af opformering i urinen. Det ser således ud til at en identisk E. faecium stamme udviste øget overlevelse og/eller evne til multiplikation i urinflaskerne ved de tre temperaturer. E. faecium betragtes normalt som en strikt fækal enterokokart
• Typning af E. faecium isolater fra Lokalitet 2 viste tre forskellige PFGE typer. Der forekom således flere forskellige E. faecium stammer som kunne overleve længere tids lagring i urin og/eller havde evnen til at kunne multiplicerer.
• I urin fra Lokalitet 2 havde alle 12 E. gallinarum stammer, som var isoleret fra såvel åben og lukket tank ved de tre undersøgte temperaturer, identisk PFGE type F. Det ser således ud til at en identisk E. gallinarum stamme udviste øget overlevelse og/eller evne til multiplikation i urinflaskerne ved de tre temperaturer.
• Fundene af øget overlevelse og/eller eventuel opformering af E. faecium og E. gallinarum i lagret urin stiller spørgsmålstegn ved at anvende enterokokker som indikator på fækal forurening
• Der skete generelt en begrænset nettoreduktion i kimtal ved 37ºC i urin i løbet af lagringsperioden. Resultaterne tyder på at bakteriekim, som kan vokse ved 37ºC, selv efter 6 måneders lagring af urin kan udvise vækst, især når urinen opbevares ved 20ºC, hvorimod der tilsyneladende ikke var nogen vækst ved 4ºC.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Januar 2004, © Miljøstyrelsen.