Miljøprojekt, 921 – Reduceret omkostninger i forbindelse med analyse af pesticider i små vanforsyningsanlæg

Reduceret omkostninger i forbindelse med analyse af pesticider i små vanforsyningsanlæg

Bilag D

1 Immunkemiske metoder (teori)

Indhold

1.1 Introduktion

Immunkemiske metoder har deres oprindelse i 1960, hvor Yalow og Berson som de første udviklede en metode til bestemmelse af Insulin i blod [15]. Siden er de immunkemiske metoder blevet en del af hverdagen indenfor klinisk kemi og anvendes blandt andet til bestemmelse af hormoner, virus og meget andet i blod og urin.

Immunkemiske metoder er blevet udbredte og populære, fordi de er billige, specifikke og simple at anvende. Udbredelsen er blevet så stor, at der i dag sælges immunkemiske kit på apoteket, hvor almindelige mennesker uden speciel baggrund, kan købe bl.a. graviditetstest, som de uden videre kan anvende hjemme på køkkenbordet.

I dag anvendes immunkemiske metoder ikke kun indenfor klinisk kemi, men også på en lang række andre felter såsom fødevare og landbrug, hvor det blandt andet bruges til at afsløre genmodificerede afgrøder. Siden starten af 90'erne har immunkemiske metoder været brugt i forbindelse med miljøanalyser til bestemmelse af både PAH'er, PCB og pesticider.

Det grundlæggende princip i immunkemi er binding imellem antistof og antigen, hvor antistoffet kan være immobiliseret på en fast overfalde, og koncentration i prøven afspejles i antal bindinger imellem antistof og antigen. Da selve bindingen ikke producerer noget signal, må der efterfølgende tilsættes en tracer, som kan bruges til at estimere antallet af bindinger. Traceren kan efterfølgende kvantificeres ved fluorescens, radioaktivitet eller enzymer/UV.

Når et fremmed legeme for eksempel influenza- eller forkølelsesvirus trænger ind i kroppen sætter det immunsystemet i gang med at producere antistof, som bindes til viruset og derved reducerer virus-aktiviteten eller gør det muligt at tilintetgøre den. Det er anslået, at dyr og mennesker kan producere omkring 100 millioner forskellige antistoffer. Det er denne mulighed for at skelne imellem millioner af molekyler, der gør antistof–antigen binding anvendelig til blandt andet miljøanalyser deriblandt pesticidanalyser.

Virus og makromolekyler såsom proteiner, polysaccarider og DNA, som kan trigge immunsystemet benævnes antigen. Pesticidmolekyler er almindeligvis så små, at selvom de bindes til antistoffer, kan de ikke forårsage en immunkemisk respons. Små molekyler, som trænger ind i legemet fjernes

ikke af immunsystemet, men ved forskellige konjugationsreaktioner .

Figur 1. Relativ størrelsesforhold imellem pesticider og partikler. De fleste pesticider er i den lave ende af pesticidstørrelsen[17]

Et molekyle, som bindes til immunsystemets makromolekyler uden at forårsage en immunrespons, benævnes hapten .

Pesticidmolekylerne trigger kun immunsystemet, hvis de er bundet til et carrierprotein som et enzymkonjugat. Måden pesticidet er bundet til carrierproteinet samt antallet er vigtigt for dannelse af det rigtige antistof med den rette selektivitet og følsomhed. Carrierproteinet er almindeligvis globulin, serumalbumin eller større hemocyanin. For serumalbumin er det optimale antal 10-20 pesticider pr. carrierprotein og 800-1000 pesticider for de store hemocyanin. Bliver antallet for stort, skygger molekylerne for hinanden, og de aktive sider er derved ikke tilgængelige. En anden vigtig ting er måden pesticidmolekylet er bundet til carrierproteinet, idet antistoffet specificeres efter den del af molekylet, som er længst væk fra carrierproteinet. Der kan opnås bedre specifikation ved at indsætte en spacer imellem carrierproteinet og pesticidmolekylet, således at molekylet er mere tilgængeligt. Det er kompliceret at fremstille den rigtige spacerstørrelse og få vendt molekylet rigtigt med den bedste side udad. Der skal som regel prøves med mange forskellige kombinationer. Urenheder i stoffet, der bindes til carrierproteinet, kan forringe antistoffets specificitet og skal derfor helst undgås.

Enzymkonjugatet skal ligeledes bruges i selve den immunkemiske metode. Derfor skal enzymkonjugatet tjene to formål, at danne antistof med den rette specificitet og at kunne konkurrere med pesticidmolekylet om antistofpladserne i den immunkemiske metode.

1.2 Fremstilling af antistof

Antistof produceres ved, at et enzymkonjugat injiceres i for eksempel en mus. Efter et stykke tid begynder musen at danne antistof imod det pågældende enzymkonjugat. Antistofferne isoleres fra musens serum og vil bestå af forskellige antistoffer, alle rettet mod forskellige dele af enzymkonjugatet. Hver B-celle producerer kun et unikt antistof. Kommer antistoffet fra forskellige B-celler er der tale om polyklonalt antistof og antistof fra en' B-celle er monoklonalt antistof.

Polyklonalt antistof er ikke særligt specifikt. Det varierer fra dyr til dyr, og produktionen stopper når dyret dør. Der kan derfor ikke garanteres for ensartet produkt i længden.

Ønskes et mere specifikt og ensartet antistof, skal der anvendes monoklonalt antistof. Til isolering og udvælgelse af den B-celle, som producerer antistof med de ønskede egenskaber, behøves en mere sofistikeret teknik.

Efter cirka 30 dage fjernes milten fra den injicerede mus og B-cellerne isoleres.

B-cellerne kan ikke gro i almindelig cellekultur, da de har en indbygget selvdestruktion, der bevirker, at de går til grunde efter et stykke tid. For at bevare B-cellerne og deres produktion af antistof klones de med kræftceller (myeloma celler), og kan efterfølgende isoleres i hver sin microtiterbrønd. Herefter undersøges antistofferne for deres specifikation, og den med de rette egenskaber udvælges, og B-cellerne kan efterfølgende opformeres og anvendes til produktion af det udvalgte antistof. De klonede B-celler kan nedfryses og anvendes på et senere tidspunkt. Fordelen ved monoklonalt antistof er, at der kan etableres en konstant produktion af ensartet antistof, og det er i princippet mere specifikt end polyklonalt antistof.

1.3 ELISA

Som tidligere nævnt (se 1.1) giver bindingen imellem antistof og antigen ikke i sig selv noget analytisk signal, men der skal benyttes en tracer, der kan give et signal, som kan henføres til antal bindinger imellem antigen og antistof. Signalet kan være fluorescens, chemiluminescens, enzymaktivitet eller radioaktivitet.

Indenfor miljøanalyser er det specielt enzymaktivitet, der benyttes, også kalde ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Princippet er, at et enzym bindes kovalent til enten antistof eller antigen som et enzymkonjugat uden at ændre på stofferne. Efter reaktion imellem antigen og antistof kan der tilsættes et substrat, som spaltes eller bindes til enzymet og giver en farvereaktion, der kan måles. Der findes forskellige principper indenfor ELISA metoderne. Der kan være tale om direkte- eller indirekte-ELISA, som igen kan inddeles i competitiv eller non-competitiv type.

I direkte-ELISA er antistoffet fastgjort, mens det er antigenet i indirekte-ELISA. I den competitiv type tilsættes der sammen med prøven enten enzymbundet antistof eller enzymbundet antigen, mens det kun er prøven i non-competitiv typen. Der kan således være tale om direkte competitiv ELISA, indirekte competitiv ELISA eller direkte non-competitiv ELISA og indirekte non-competitiv ELISA.

I de kommercielle pesticid kit benyttes udelukkende den direkte competitiv ELISA[15], hvor en begrænset mængde antistoffet er fastgjort til en overflade, se figur 2. Samtidig med prøven tilsættes en kendt mængde enzymkonjugat, som konkurrerer med pesticidet fra prøven, om de begrænsede pladser på antistoffet. Efter et separationsstep, hvor overskydende enzymkonjugat og prøve fjernes, måles koncentrationen ved, som tidligere omtalt at tilsætte et substrat, der spaltes eller bindes til enzymkonjugatet og herved danner en farve, som kan måles spektrofotometrisk. Farveudviklingen er direkte proportional med mængden af enzymkonjugat bundet til antistoffet og derved omvendt proportional

med pesticidkoncentrationen i prøven. Det vil sige, at høj pesticidkoncentration i prøven giver svag farve, mens lav koncentration giver meget farve.

Figur 2. Princippet i den mest almindelige ELISA-metode, direkte competitiv ELISA.

1.4 Fremgangsmåde i immunkemisk metode

To forskellige type af kit er tilgængelige og varierer kun i måden antistoffet er fastgjort på. I den ene type er antistof fæstet i rør eller microtiterplader. I den anden type er antistoffet bundet til 1 m store magnetiske partikler. Til den første type tilsættes prøven, typisk 100-200l og en kendt mængde enzymkonjugat. I den anden type tilsættes i et rør en kendt mængde magnetisk antistof sammen med prøven og enzymkonjugat. Efter en reaktionstid på 10-60 minutter, hvor stoffet i prøven konkurrerer mod enzymkonjugatet om de begrænsede antistofpladser, vaskes den overskydende prøve og enzymkonjugat bort. For de magnetiske partikler dog først efter, at røret er placeret i et magnetisk felt, som suger partiklerne fast til siderne. Herefter tilsættes et chromogen, der reagerer med det bundne enzymkonjugat. Efter en tid stoppes reaktionen, og farven måles med et spektrofotometer eller en pladelæser.

Farveintensiteten er omvendt proportional med pesticidkoncentrationen i prøven.

Da farven er i det synlige område, kan de immunkemiske kit udover kvantitativ bestemmelse, anvendes til simpel visuel kvalitativ eller semi-kvantitativ afgørelse.

I en kvalitativ afgørelse sammenlignes farven fra den ukendte prøve med en blindprøve. Er farven mere svag end blindprøven, er der pesticid i prøven.

I den semi-kvantitative bestemmelse afgøres om farveudviklingen er mere eller mindre intens end en standard på bestemt niveau. Indholdet vil så enten være over eller under standardens niveau.

Der er flere grundlæggende begreber, som går igen i beskrivelser af de immunkemiske kit, og derfor kræver det en nærmere beskrivelse af krydsreaktion, standardkurve, detektionsgrænse og måleområde.

1.5 Krydsreaktion

Krydsreaktion er antistoffets affinitet for andre molekyler, end det antistoffet er beregnet til. Dette kan sammenlignes med interferens i almindelige kemiske analyser. Andre stoffer reagerer med antistoffet, fordi de har næsten samme opbygning og tredimensionelle struktur, se figur 3. For at forebygge krydsreaktion skal antistoffet være meget specifikt, hvilket almindeligvis ikke er praktisk og økonomisk muligt.

Krydsreaktiviteten er ofte angivet som IC₅₀, hvilket er den koncentration af stof, der skal til for at halvere signalet 50%B/B0 i forhold til maksimal signal 100%B/B0. Der kan ligeledes være angivet en detektionsgrænse for den pågældende krydsreaktant.

Med disse værdier for krydsreaktiviteten kan det vurderes, hvilken betydning andre stoffer i prøven vil få på det forventede resultat eller, om der er andre kommercielle kit, der måske er bedre egnet til opgaven. På grund af krydsreaktioner vil resultatet fra en immunkemisk metode være sammensat af bidrag fra analyten plus alle krydsreaktanter, der er i den ukendte prøve.

En lav detektionsgrænse for en krydsreaktant indikerer, at det immunkemiske kit er meget følsomt over for netop dette stof. En lav detektionsgrænse kombineret med en relativ høj IC₅₀ værdi antyder, at standardkurven for den pågældende krydsreaktant har en anden hældning end for analyten. Er koncentration af analyten og krydsreaktant nær detektiongrænsen vil en sådan krydsreaktant give væsentligt bidrag til resultatet. Ved højere koncentration af analyten og krydsreaktanten vil den få mindre betydning for resultatet.

Figur 3. Strukturen af atrazin, samt metaboliter og nærtbeslægtede stoffer.

1.6 Standardkurve

I de immunkemiske pesticid kit er signalet omvendt proportional med koncentrationen i prøven.

En typisk standardkurve, hvor logaritmen til koncentration (x-aksen) plottes mod signalet/absorbansen (y-aksen), vil have et sigmoidal-form, se figur 4, med et lineært område omkring IC₅₀ (koncentrationen, hvor halvdelen af antistoffet er mættet med prøve).

Figur 4. Typisk sigmoidal standardkurve. LDD er detektionsgrænsen, IC₅₀ er koncentrationen, hvor halvdelen af antistoffet er besat med prøve, LOQ er øvre og nedre grænse for kvantifikation.

For at sammenligne kurveforløbet normaliseres signalet typisk til %B/B₀ efter følgende formel.

hvor A er absorbansen for standarden, A0 er absorbansen for blindprøven og Aoverskud er absorbansen for en standard med stort overskud af stof. En øvet tekniker kan på kurveforløbet hurtigt afgøre, om der eventuelt er noget galt.

For at finde koncentrationen i en ukendt prøve skal standardkurven transformeres til en ligning.

Der er foreslået mange forskellige måder at transformere kurven til en ligning. Den mest brugte er anvendelse af det normaliserede respons til lineært fit efter følgende:

De fleste pladelæsere har indbygget kurvefitingsprogram, der hurtig transformerer de målte standarder til en lineær standardkurve og regner koncentration i prøverne.

1.7 Detektionsgrænsen og måleområde

Følsomheden for en immunkemisk metode angives ligesom konventionelle analytiske metoder ved en detektionsgrænsen LDD (least detectable dose) og en kvantificeringsgrænse LOQ (limet of quantification).

Detektionsgrænsen angives som den mindste koncentration, der giver et signal, som kan adskilles fra nul med en hvis sikkerhed. Den beregnes enten som den koncentration, der mætter 10% af antistoffet (%B/B0 = 90%), se figur 4, eller som 3 gange standardafvigelsen fra gentagne målinger af en blindprøve.

Kvantificeringsgrænsen LOQ er niveauet, hvor resultatet kan angives med en vis præcision eller sikkerhed. Denne grænse sættes skønsmæssigt til den lineære del af standardkurven. Da det lineære område typisk starter omkring %B/B₀ = 90%, vil LOQ og LDD have samme værdi. Dog kun hvor detektionsgrænsen angives som %B/B₀ = 90%.