Miljøprojekt, 991 – Bakterievækst og tilsætningsstoffer – Bilag D Eftervækstpotentiale: Adenosine TriPhosphate (ATP)

Bakterievækst og tilsætningsstoffer

Bilag D Eftervækstpotentiale: Adenosine TriPhosphate (ATP)

Analysevejledning

ATP er energibærende molekyler i alle levende celler og kan bruges som et mål for bakteriedensitet. Luciferase fra ildfluer katalyserer reaktionen mellem D-luciferin og ATP:

Reaktionen danner lys, som kan måles i et luminometer (angives i relative light units: rlu). Mængden af lys er proportionel med mængden af ATP, og ATP koncentrationen beregnes ved hjælp af en ATP-standardkurve.

Analysen forløber i tre trin:

1. Ekstraktion af ATP fra bakteriecellerne

2. Tilsætning af luceferin/luciferase reagens

3. Måling af lysudsendelsen

Da prøvens karakter (f.eks. farve, partikler, pH, celledensitet) og forskelle mellem prøve og medie ATP-standarder er fremstillet i, kan påvirke resultatet, er det nødvendigt også at måle en parallel prøve tilsat en kendt mængde ATP (intern standard: IS).

Ud fra målingen med intern standard bestemmes en tælleeffektivitet (E) for prøven. Denne anvendes til at korrigere den målte rlu værdi for prøven, før denne omregnes til en ATP koncentration ud fra en ATP-standardkurve.:

formel

De aktuelle prøver blev målt med Lumin(ATE)/Lumin(EX)-kit (Celsis) på et Advance Coupe luminometer (Celsis) med automatisk reagenstilsætning.

100 µL prøve blev tilsat 100 µL ekstraktionsreagens. Efter 10 sekunders ekstraktionstid blev tilsat 100 µL luceferin/luciferase reagens, og efter 2 sekunder måltes lysudsendelsen over 10 sekunder.

For hver prøve blev foretaget enkeltbestemmelse på prøve og prøve tilsat intern standard. Et fælles gennemsnit og standardafvigelse blev bestemt for hvert sæt triplikater ved brug af fejlophobningsloven.

Rådata

tabel