Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 95 – Virkningsmekanismer for neurotoksisk effekt af mangan og kombinationseffekt af mangan og chlorpyrifos og maneb

Virkningsmekanismer for neurotoksisk effekt af mangan og kombinationseffekt af mangan og chlorpyrifos og maneb

Dansk resume

Mangan er en vidt anvendt co-formulant i pesticidpræpatater og udgør en integreret, organisk bunden del af to pesticider: maneb og mancozeb. Mangan kan forårsage neurotoksicitet, manganisme/parkinsonisme, efter erhvervsmæssig eksponering. Manganisme deler mange symptomer med Parkinson’s sygdom. Epidemiologiske undersøgelser dokumenterer, at arbejdere i landbrug, havebrug og personer som bor nær områder med hyppig anvendelse af pesticider har forøget risiko for at udvikle symptomer på Parkinson’s sygdom.

Der er mulighed for interaktion, endog potensering, mellem mangan og pesticider i relation til neurotoksicitet. Der vides intet sikkert om sådan potentiel interaktion, men dette projekt søger at bidrage med viden herom. Resultaterne kan i givet fald anvendes til at beskytte mennesker mod erhvervsmæssig og miljømæssig eksponering for mangan og pesticider alene eller i kombination.

Der antages at være en interaktion mellem de neurotoksiske effekter forårsaget af mangan og pesticider specielt i relation til Parkinson’s sygdom. De tilgrundliggende mekanismer og deres mulige interaktion søges belyst gennem en integreret, multidisciplinær indfaldsvinkel bestående af morfologiske, immunhistokemiske og neurokemiske metoder under anvendelse af unge Sprague Dawley hanrotter som model.

Udover mangan, doseret som manganklorid, valgtes to pesticider: chlorpyrifos som er vidt anvendt og har veldokumenterede effekter på det cholinerge nervesystem og maneb, et fungicid med organisk bundet mangan. Der udførtes dose-range indersøgelser for hvert af disse tre kemikalier for at sikre egnede doseringsniveauer i kombinationsstudiet, i hvilket de tre kemikalier blev administreret alene, i alle kombinationer med to kemikalier, og når de alle tre blev doseret sammen.

I patienter med Parkinson’s sygdom, reduceres dopaminkoncentrationen dramatisk i hjernens basalgaglier, specielt i corpus striatum, som en konsekvens af degeneration af dopaminerge neuroner, som udspringer i substantia nigra og sender udløbere til corpus striatum. Den basale, tilgrundliggende mekanisme herfor kendes ikke, men induktion af oxidativt stress og apoptose synes at være centrale elementer.

Dopaminkoncentrationen valgtes som en vigtigt effektparameter ligesom koncentrationerne af noradrenalin, 5-hydroxytryptamin og forskellige aminosyrer med neurotransmitter funktion [glutamat, taurin og GABA (γ-aminosmørsyre)] og aktiviteten af cholinesteraser blev undersøgt. Disse effektparametre anvendtes som indikatorer, biomarkører, for påvirkning af tilhørende dele af centralnervesystemet. Herudover foretoges kvantitativ bestemmelse af to relevante proteiner, α-synuclein og synaptophysin, og af aktiviteten af caspase-3 enzymet, som er tæt forbundet med apoptotisk neurodegeneration. Histokemiske farvninger valgtes for at diskriminere mellem nekrotisk og apoptotisk neurodegeneration og effekterne på det catacholaminerge system, det vil sige haematoxylin-eosin, gliafibrillært surt protein, TUNEL og tyrosin hydroxylase. Fokus blev rettet mod corpus striatum og substantia nigra, men resten af hjernen blev også undersøgt.

Der var alvorlige problemer med den intraperitoneale dosering med manganklorid, fordi dyrene blev tydeligt generet heraf. Denne doseringsvej anvendes ofte i manganundersøgelser, men sådanne symptomer er ikke raporteret. Den højeste dosis manganklorid var 2,5 mg/kg legemsvægt/dag for maksimalt 12 uger. Dette øgede mangankoncentrationen i corpus striatum, resthjernen og plasma. Dosering med manganklorid i 12 uger reducerede svagt de striatale koncentrationer af dopamin, glutamat, taurin, GABA og acetylcholinesteraseaktiviteten. Disse reduktioner var minimale og anses ikke at give anledning til neurotoksicitet. Koncentrationerne af α-synuclein og synaptophysin og de histologiske parametre var ikke påvirkede.

Dose-range undersøgelsen med subkutan dosering med chlorpyrifos i doserne 2,5, 15 og 30 mg/kg legemsvægt/uge i 12 uger viste øget dopaminkoncecntration svarende til de to laveste doser. Der var ingen effekt på koncentrationerne af striatale aminosyrer med neurotransmitterfunktion, hvorimod aktiviteten af acetylcholinesterase reduceredes dosisafhængigt. Koncentrationerne af α-synuclein og synaptophysin og de histologiske parametre var ikke påvirkede.

Dose-range undersøgelsen med intraperitoneal dosering med maneb i doserne 7,5, 15 og 30 mg/kg legemsvægt/uge i 12 uger viste dosisafhængig øget mangankoncentration i corpus striatum. Koncentrationen af 5-hydroxytryptamin øgedes dosisafhængigt i både corpus striatum og resthjernen, hvilket betragtes som tidligt tegn på neurotoksicitet. Den striatale aktivitet af acetylcholinesterase var ikke påvirket. Koncentrationen i corpus striatum og resthjerne af aminosyrer med neurotransmitterfunktion, α-synuclein og synaptophysin samt de histologiske parametre var ikke påvirkede. Det var udenfor dette projekts rammer at identificere specieringen i hjernen af det mangan, som stammede fra maneb. Derfor kunne effekter ikke fortolkes i relation til manganspeciering.

På basis af resulteterne fra disse tre studier udvalgtes følgende doser til kombinationsstudiet: mangan, 2,5 mg mangan/kg legemsvægt/dag i 12 uger som intraperitoneal dosering med manganklorid; chlorpyrifos, 15 mg chlorpyrifos/kg legemsvægt/uge i 12 uger som subkutan dosering; maneb, 10 mg maneb/kg legemsvægt/uge i 12 uger som intraperitoneal dosering. Udover kontrolgruppen doseredes med mangan, chlorpyrifos og maneb enten alene, i alle tre kombinationer med to kemikalier og hvor alle tre blev doseret, det vil sige i alt 8 grupper.

Mangan og maneb øgede den striatale koncentration af mangan. Ved samtidig doesring med mangan og maneb var koncentrationerne i overensstemmelse med additiv effekt. Samtidig eksponering med chlorpyrifos og maneb reducerede striatale dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer. Aktiviteten af acetylcholinesterase i striatum blev reduceret i alle grupper doseret med chlorpyrifos, hvilket også iagttoges ved enkeltdosering med maneb og samtidig dosering med mangan og maneb. Det var bemærkelsesværdigt, at enkeltdosering med maneb og samtidig dosering med mangan og maneb også reducerede striatale koncentrationer af glutamat, taurin og GABA. Aktiviteten af caspase-3, koncentrationerne af α-synuclein og synaptophysin og de histologiske parametre blev ikke påvirket af nogen dosering.

Det konkluderes, at enkeltdosering med mangan, chlorpyrifos og maneb påvirkede forskellige neurokemiske effektparametre af relevans for induktion af neurotoksicitet relateret til Parkinson’s sygdom. I kombinationsstudiet påvistes også ændrede neurokemiske effektparametre. Der var intet klart, konsistent mønster af ændringer og ingen synergistiske effekter, herunder potensering, blev afsløret under de forsøgsomstændigheder, som anvendtes i projektet. Dette udelukker imidlertid ikke, at andre forsøgsomstændigheder ikke ville have kunnet afsløre et konsistent mønster af ændrede biomarkører og synergistiske effekter. Der er stadig et potentiale for sådanne effekter som behøver at blive grundigt undersøgt.