| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Bekæmpelse af sygdomme i frøbede af Nordmannsgran ved hjælp af biologiske og kulturtekniske metoder i skovplanteskoler

6 Antagonistforsøg i kontrolleret miljø med Pythium ultimum smitte

Med henblik på at øge kendskabet til antagonistiske egenskaber over for et enkelt patogen, der har betydning i planteskolen udførtes potteforsøg med tilført smitstof af Pythium ultimum var ultimum. Isolatet 1983, der er isoleret fra baitingforsøget fra Fosdal jord (kapitel 2) og testet i smitteforsøg (kapitel 4) blev anvendt.

6.1 Antagonistforsøg 2002/2003

Der blev udført et forsøg hvori indgik antagonisterne: Clonostachys rosea IK726, Supresivit, TRI 003 og en mælkesyrebakterie (leveret af Birthe Jelle, Chr. Hansen A/S, specifik stamme fortrolig). Øvrige præparaters oprindelse se tabel 7.1. Udvælgelsen af antagonister til bekæmpelsesforsøg skete i forhold til:1) kendt effekt mod Pythium og Fusarium svampe 2) kommerciel tilgængelighed og 3) mulighed for rodkolonisering. Endelig blev mælkesyrebakterier medtaget for sammenligning i denne test på grund af deres generelle antifungale virkning.

Frøpartiet var det tidligere anvendte og testede parti, høstet 2000, testet 2002 ((015/00 Tversted F526- A3113). I forsøget indgik parametre som post-coatning (efter stratificering) og precoatning (før stratificering) samt forskellige smitteniveauer af patogenet: 0,1 %, 0,5 % og 1 %. Endvidere indgik forskellige typer af applikationsmetode for C. rosea IK 726: 1) spagnum/klid formulering, 2) lerformulering og 3) en udvasket sporesuspension.

I tilknytning til forsøget blev der foretaget pladespredninger af frøene før udsåning for bestemmelse af antagonisternes overlevelse.

Forsøget havde til formål

  1. at undersøge forskelle i effekten af antagonister når de tilføres frøet som ”post-coatning”, dvs. efter stratificering eller ”pre-coatning” dvs. i forbindelse med opstart af stratificering
  2. at sammenligne inkubering ved 15°C i 3 dage før stratificering ved 3°C med direkte stratificering ved 3°C

6.1.1 Materialer og metoder

Inokulum blev produceret i sphagnum/ klid/ vand, nedtørret og findelt jfr. metodik kapitel 4. Fastlægning af smitteniveau skete med afsæt i den klassiske dosis respons-kurve der var konstateret i smitteforsøget kapitel 4. I forsøget anvendtes 0,5 % smitstof.

Dag 1

Udførtes støbsætning/antagonistbehandling (pre-coatning). Start-vægt (samlet) + start-vandindhold blev registreret for frøene.

Alle frøene blev skyllet i rindende vand i 3 timer i netpose i balje, derefter hældt over i en sigte og skyllet i 1 minut. Efter afdrypning og aftørring med klæde, blev frøene vejet igen og vandindholdet beregnet på basis af start-vægt og start-vandindhold. Frø pr. behandling blev afvejet og 'target'-vægt ved 33 % vandindhold beregnet.

Følgende behandlinger indgik her:

  1. Trichoderma harzianum TRI 003: 3 dage ved 15°C og derefter flyttet til 3°C
  2. TRI 003 – som 1 men direkte ved 3°C
  3. Clonostachys rosea IK726 : 3 dage ved 15°C og derefter flyttet til 3°C
  4. IK 726 – som 3 men direkte ved 3°C
  5. mælkesyrebakterier i eget substrat – placeret 3 dage ved 15°C og derefter flyttet til 3°C
  6. mælkesyrebakterier nedcentrifugeret – 3 dage ved 15°C og derefter flyttet til 3°C
  7. vand - 3 dage ved 15°C og derefter flyttet til 3°C (Kontrol)
  8. -12. Direkte ved 3°C

Mængde af svampeantagonisterne tilført og overlevelsen på frøene umiddelbar efter coatningen (målt for behandling 1-2 og 3-4) fremgår af tabel 6.1

Bakterier: behandling 5 og 6 henholdsvis 80 ml bakterier i mediet og bakterier i vand rystet 10 minutter.

Vand: frø i behandling 8-12 rystet i 240 ml vand i 10 minutter. Resten jfr. proceduren ovenfor.

Dag 2

Fra alle prøver blev udtaget 5 frø til pladespredning (frø opbevaret ved 5° natten over i Petri skåle).

Dag 6

Vandindholdbestemmelser for alle behandlingerne, og hvis nødvendigt, blev vandindholdet justeret. (Frøenes nye vægt + vandindhold blev brugt til at beregne 'target-vægt').

Uge 6

Frøene blev lagt ud til forspiring (vådt filterpapir 15°C).

Uge 7

Frøene blev flyttet til 5°C for at bremse spiringen.

Uge 8

Uspirede frø blev sorteret fra i alle behandlinger. Fra ubehandlede frø (behandling 8-12) blev der udtaget frø til post-coatning som følger:

  1. 726 ler 0.2 i 20 ml (2 x 109 cfu pr. g
  2. 726 sph/klid 0.5g i 20 ml (9 x 108 cfu pr. g)
  3. 726 siet sph/ klid (som ovenfor)
  4. ubehandlet
  5. ubehandlet (usmittet)

Der blev udsået 7 forspirede frø pr. potte x 5 gentagelser, alle smittet med 0,5 % Pythium ultimum var ultimum IK1983 (0,1 g til 25 g sphagnum/sand) (bortset fra behandling 12).

Fremspirede raske og fremspirede døde blev registreret efter 7, 14, 21 og 26 dage.

Resultater blev behandlet statistisk med SAS Proc glm procedure hvor Bonferroni (Dunn) t test blev anvendt for sammenligning af behandlingerne.

Tabel 6.1: Dosis af antagonister i præparater og genfund på frø efter coatning

Behandling Dosis anvendt
x 106 pr g frø 		Dosis genfundet på frø efter coatning
x 106 pr g frø
1. TRI 003, 3 d v. 15°C 3.4 1.1
2. TRI 003, 3°C 3.4 1.1
3. IK726, 3 d v. 15°C 18.6 0.1
4. IK726, 3°C 18.6 0.1
8. IK 726 ler post 114 -
9. IK 726 sph/klid post 157 -
10 IK 726 siet post <157 -

6.1.2 Resultat

Af figur 6.1 fremgår antal raske fremspirede 26 dage efter udsåningen. Der er stor variation på fremspiring indenfor behandlingerne. Resultaterne viste at IK726 og TRI 003 pre-behandlet og direkte på køl (behandling 2 og 4) samt alle tre post-behandlede med IK726 (beh. 8,9 og 10) var statistisk lavere end usmittet kontrol, men ikke statistisk forskellig fra smittet kontrol (beh. 7 og 11). Endvidere var TRI 003 inkuberet 3 dage ved 15 °C (beh. 1) statistisk bedre end tilsvarende behandling stillet direkte på køl (beh. 2)(alle vist ved p <0.05 niveauet ved Bonferroni (Dunn test). Der var en generel tendens, men dog ikke underbygget statistisk, til at pre-coatning af frø kan være fordelagtig.

Figur. 6.1. Behandlinger mærket (1) er inkuberet i 3 dage ved 15°C før de blev flyttet til stratificering ved 3°C. Behandlinger mærket (2) blev stillet direkte til stratificering. (Øvrige benævnelser vedrørende behandlinger se rapporttekst).

Figur. 6.1. Behandlinger mærket (1) er inkuberet i 3 dage ved 15°C før de blev flyttet til stratificering ved 3°C. Behandlinger mærket (2) blev stillet direkte til stratificering. (Øvrige benævnelser vedrørende behandlinger se rapporttekst).

6.2 Parallelforsøg til markforsøg 2003 i potter inokuleret med Pythium ultimum var ultimum

I 2003 blev der udført markforsøg med antagonister, der havde vist størst effekt i første års markforsøg. Dette markforsøg blev sammenholdt med et smitteforsøg i væksthus, hvori indgik de behandlede frø til markforsøget, men udsået i potter med tilsat smitte af Pythium ultimum var ultimum 1983. En forbehandling (pre-coatning) og en efterbehandling (post-coatning) med antagonister i forhold til stratificeringen blev sammenlignet.

6.2.1 Materiale og metoder

Frøparti 031/02 F526 Tversted testet med 65 % spiring (se kapitel 2) Metodik ved coatning og antal af cfu ved coatning, og udsåning henvises til kapitet 7. Frø behandlet til markforsøget blev udtaget og sået i potter kunstigt inokulerede med Pythium ultimum var ultimum isolat 1983. Inokulum blev produceret i sphagnum/ klid/ vand, nedtørret og findelt jfr. metodik kapitel 4 og tilsat 0,4 % i blandet det øvre jordlag.

Potteforsøg blev opstillet som markforsøg bortset fra at behandlingerne 1-9 blev tilsat smitte af Pythium, derfor en ekstra behandling 10 (der var opstillet med samme frø som for behandling 9) uden smitte.

  1. TRI 003 (T. harzianum) precoatn.
  2. IK 726 (C. rosea) precoatn ler
  3. IK726 precoatn. Sphagnum/klid
  4. TRI 003 postcoatn.
  5. IK 726 postcoatn. ler
  6. IK726 postcoatn. sph/ klid
  7. Supresivit (T. harzianum) postcoatn.
  8. Ubehandlet (ler precoatn.)
  9. Ubehandlet
  10. Ubehandlet og usmittet

200 frø pr. behandling blev udsået med 8 frø pr. potte i 25 potter. Substrat: Som tidligere anvendes sphagnum blandet med sand i forholdet 4:1. Til behandling 1-9, ialt 225 potter, blev tilsat 0,1g inokulum blandet i 25g sphagnum sand pr. potte. Al inokulum blev lagt over frøene efter udsåning.

Potterne blev tilset med vanding i 7 uger og planterne talt ugentlig, med første tælling 14 dage efter udsåning. Resultater blev behandlet statistisk med SAS Proc glm procedure hvor Bonferroni (Dunn) t test blev anvendt for sammenligning af behandlingerne.

6.2.2 Resultater

Resultater af tællingerne ses i tabel 6.1.

Der blev fundet statistisk højere fremspiring i forhold til den smittede kontrol af TRI 003 pre-behandling (beh. 1) ved første tælling efter 14 dage og TRI 003 pre-behandling (beh. 1) og C. rosea IK726 prebehandlet med ler (beh. 2) efter 2. tælling efter 3 uger. Ved øvrige tællinger var der ikke tale om statistisk effekt, men pre-coatning med antagonister (behandling 1, 2 og 3) lå i de fem første uger på ca. dobbelt plantetal i forhold til kontrollen og for behandlingerne 1 og 2 holdt tendensen gennem hele optællingsperioden. Coatning efter stratificeringen viste ingen positiv effekt. Fig. 6.2. viser udviklingen grafisk på tre opgørelsestids-punkter.

6.3 Diskussion og Konklusion

I forsøget beskrevet i 5.1 blev der fundet at frøpartiet 015/00 - der var testet egnet og anvendt i markforsøget 2002 - i 2003 havde en meget dårlig fremspiring. Antal forspirede frø, der kunne udsås i forsøget var således kun ca.10 %. I overensstemmelse med dette er A. nordmanniana kendt for kun at kunne lagres i forholdsvis kort tid. Frøene kan derfor have været lavvitale og coatningen med antagonister dermed resultere i kritisk øget konkurrence om ilten efter udsåningen. Det er velkendt fra arbejdet med biologiske frøbehandlinger, at frøvitaliteten skal være god (selvom der godt kan være tale om et meget patogent- inficeret frøparti). Resultatet medførte valg (test) af nye frøpartier (se kapitel 2.1.) til de videre forsøg.

Når vi i ovenstående forsøg ser en bedre fremspiring af frø inkuberet ved 15°C i 3 dage (se behandlinger mærket (1) fig. 6.1) efterfulgt af almindelig stratificering end for de direkte stratificerede (2) kan dette måske skyldes de fysiologiske ændringer af frøet, idet også vandbehandlingen (7) havde statistisk tilsvarende højt gennemsnit. Metoden med få døgns inkubering ved højere temperatur benyttes ved de følgende års markforsøg (2003 og 2004)

Tabel 6.1. Gennemsnit af fremspirede raske Abies planter pr potte i parallelforsøg til markforsøg opsat i 25 gentagelser ved 15°C. Der er udsået 8 frø pr. potte. Behandling nr. 1-9 tilført Pythium ultimum var ultimum IK 1983. Resultater opgjort fra d. 21. 5 (14 dage efter såning) og indtil 7 uger efter såning.

No Behandling 14 dage 3 uger 4 uger 5 uger 6 uger 7 uger
1 TRI 003 pre 1.16 A1 1.8 AB 2.12 A 2.16 A 1.96 A 2.12 A
2 IK 726 pre-ler 0.76 ABC 1.96 A 2.0 AB 1.84 AB 2.12 A 1.96 A
3 IK 726 pre s/k 0.96 AB 1.36 ABC 1.4 ABC 1.8 AB 1.36 AB 1.4 AB
4 TRI 003 post 0.24 CD 0.68 C 0.96 BCDE 0.92 BCD 1.0 AB 1.04 AB
5 IK726 post-ler 0.12 D 0.56 C 0.52 CDE 0.8 BC 0.8 B 0.88 B
6 IK 726 post-s/k 0.08 D 0.2 E 0.28 E 0.76 BC 0.76 B 0.68 B
7 Supresivit 0.24 CD 0.92 BC 1.2 ABCDEFG 1.2 ABCD 1.04 AB 1.12 AB
8 Pre-ler 0.52 BCD 1.2 ABCD 1.6 ABCDEF 1.6 ABCD 1.36 AB 1.28 AB
9 Ubehandlet 0.39 BCD 0.8 CDE 1.08 ABCDEFG 0.96 ABCD 1.36 AB 1.28 AB
10 Ubeh/usmittet 0.7 ABCD 1.2 ABCD 1.79 ABCDEFG 2.04 ABCD 2.08 A 1.84 A

1gennemsnit efterfulgt af forskelligt bogstav statistisk forskellig i henhold til Bonferroni (Dunn) t test ved p=0.05

Figur 6.2. Raske, spirede <em>Abies</em> kimplanter pr. potte i smitteforsøg drivhus. (potter inokuleret med <strong>Pythium ultimum var ultimum 1893 </strong>). Parallelforsøg til markforsøg 2003. 1. søjle talt efter 14 dage, 2. søjle efter 3 uger og 3. søjle efter 5 uger. * markerer behandlinger statistisk forskellige fra ubehandlet kontrol i henhold til Bonferroni (Dunn) t test ved p=0.05

Figur 6.2. Raske, spirede Abies kimplanter pr. potte i smitteforsøg drivhus. (potter inokuleret med Pythium ultimum var ultimum 1893 ). Parallelforsøg til markforsøg 2003. 1. søjle talt efter 14 dage, 2. søjle efter 3 uger og 3. søjle efter 5 uger. * markerer behandlinger statistisk forskellige fra ubehandlet kontrol i henhold til Bonferroni (Dunn) t test ved p=0.05

I parallelforsøg til markforsøget med frøparti 031 testet 2003 (1 år efter høst af frøpartiet) sås der en overordnet god effekt af behandlinger før stratificering. Antallet af fremspirede planter var statistisk højere i behandling med lerformuleret C. rosea IK726 og T. harzianum TRI 003 i forhold til lerbehandling alene. Der må således konkluderes, at der ved kort fremspiringsperiode og højt sygdomstryk af P. ultimum kunne vises en effekt af antagonistbehandlinger påført før stratificering.

 

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |



Version 1.0 November 2005, © Miljøstyrelsen.