| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Bekæmpelse af sygdomme i frøbede af Nordmannsgran ved hjælp af biologiske og kulturtekniske metoder i skovplanteskoler

5 Antagonistkolonisering af frø

5.1. Undersøgelse af dækningsgrad af Clonostachys rosea IK726 ved tre forskellige typer formuleringer

Tre forskellige formuleringer af C. rosea: ler, spagnum/klid eller udvaskede sporer blev undersøgt med formålet at undersøge den optimale tilførsel af antagonisten set i forhold til overlevelse på frøet. Dette blev undersøgt i sammenhæng med stratificering

5.1.1 Materialer og metoder

Tre formuleringer lerinokulum, spagnum klid og vaskede sporer blev tilført frøene som vandige opløsninger indeholdende i alt 2 x 10⁷ cfu (kolonidannende enheder) pr ml der tilsættes som 20 ml suspension til 120 g frø. Frøenes vandindhold (mc) blev holdt på 33% (justeret ved tørring og opfugtning). Frøene blev opbevaret ved 3°C.

Antallet af spiredygtige enheder blev målt ved pladespredning (lige efter coatningen og efter 8 dages stratificering) og ved dækningsgrad målt på frø stratificeret 8 dage, og derefter inkuberet på fugtigt blotter papir i 8 dage (NUV, 20°C) og derefter aflæst ved stereomikroskopi. Der blev bedømt efter en skala fra 0 til 3 for dækningsgrad. Karaktererne var følgende: lidt vækst: 1, ca halvdelen af frøene dækket: 2 og mere end 2/3 dækket: 3.

5.1.2 Resultater

Den sammenlignende undersøgelse af 3 formuleringer (1. sphagnum/klid, 2. udvasket sporesuspension fra sphagnum/klid og 3 ler) resulterede i følgende: Umiddelbart efter coatningen viste pladespredningerne lavest mængde cfu i coatningen med den udvaskede spore-suspension (2) og efter 8 dages stratificering var forholdet således at der var 3 gange så høje mængde cfuer på pladespredninger fra frø med spagnum/klid formuleringen (1) som fra frø coatede med sporesuspensionen (2); og fra frø coatede med lerformuleringen (3) var der >5 gange så mange cfuer, som fra frø med sporesuspension (se tabel 5.1).

Tabel 5.1. Resultat af sammenlignende test af overlevelse af Clonostachys rosea IK726 ved forskellige formuleringer

* cfu= kolonidannende enheder pr. g frø
** Høj frekvens af Penicillium

Resultater fra blotter testen viste ikke signifikant forskel i dækningsgrad ved de tre coatninger, der alle lå på et gennemsnit omkring 2,0 (dvs. at frøene var ca. halvt dækkede med C. rosea). Den kraftigste sporulering sås ved spagnum/klid formuleringen.

5.2 Vækst af C.rosea på frø undersøgt ved anvendelse af gfp-mærket isolat

For yderligere at klarlægge hvorledes koloniseringen af C. rosea foregår på frøet blev der udført et forsøg - hvor frø blev behandlet med antagonisten ved begyndelsen af stratificeringen. Coatning skete med en gfp-mærket C.rosea (d 11). GFP genet er isoleret fra bioluminescent vandmand og indsat i C. rosea IK726 ved kontrol af konstitutiv gpd promotor og trpC terminator begge fra Aspergillus niger. GFP genet bevirker, at det resulterende gfp-protein fungerer som reporter molekyle for gen expressionen, hvorved aktiv vækst af den mærkede svamp kan følges ved fluorscence mikroskopi (Lübeck et al., 2002).

5.2.1 Metode

Tre portioner af frø anvendes til stratificering. Stratificeringsprocessen følger den tidligere beskrevne procedure (afsnit 3.1).

1g sphagnum/klid inokulum indeholdende C.rosea d11 vaskes i 10 ml vand og filtreres. Sporekoncentration i suspensionen er 1.3 x 10⁸. To hold frø á 5 g rystes med 1.7 ml sporesuspension, der resulterer i m.c. på 33%. Det ene hold tilføres 0.1% af det farvede bindemiddel, sepiret. Det tredje hold frø tilsættes vand alene.

Frøene stilles ved 3°C i plastpetriskåle i plastpose med mulighed for ilttilførsel, men med lav fordampning. Frøene omrystes dagligt og hver uge justeres vand efter vægt til 33% mc i frø.

Der foretages ugentligt mikroskopi i Leica fluorescens stereomikroskop med et gfp filtersæt med 480 nm excitationsfilter og 510 nm barriere filter.

5.2.2 Resultat

Ganske svag mycelie vækst af C.rosea kunne observeres på frøene, men der var også vækst af andre svampe. På frøets overflade blev der iagttaget mindre vækst på vingeintegumentet sammenlignet med den synlige testa (inklusive den tynde vinge (fig. 5.1). Testa ligger synlig blottet i en spalte dannet af det øvre vingeintegument (fig. 5.2). Her er der en jævn dækning efter 5 dage ved 3°C. og efter 14 dage ses samme dækningsgrad. Efter 21 dage findes der sporulerende C. rosea. Der var ikke synlig forskel på væksten +/- sepiret

5.2.3 Konklusion

Det er gode perspektiver for en coatning samtidig med statificeringen, idet antagonisten overlever kuldebehandlingen af frøet. Der er noget der tyder på, at der kan være forskel i overlevelsen af sporer efter coatningsmetode, men at dette muligvis kan kompenseres i vækst. Det skal dog understreges at blotter testen ikke vil afspejle situationen i jorden, men kun kan give en antydning af potentialet af svampen.

Figur 5.1. Abies frø coatede med gfp mærket C. rosea IK726 og stratificeret. Detalje fra testa efter 5 dages stratificering. Eksempel på særlig tæt vækst ved pilen

Figur 5.2. Principskitse af Abies nordmanniana-frø

Alle coatningsmetoder resulterer i et antal spiredygtige enheder, der ser realistiske ud i forhold til bekæmpelseseffekter (Jensen et al., 2002). En uvasket sphagnum/klid inokulering giver ekstra næring til antagonisten, hvilket kunne afspejles i en større grad af sporulering, når frøene inkuberedes ved en høj temperatur. En sådan næringstilførsel kan imidlertid også tænkes at være et problem, hvis frøene i forvejen har en naturlig mikroflora der kan ernæres og derved skade fremspiringen. Omvendt kunne en udvasket suspension (uden næring) give færre spiredygtige enheder på frøet, men svampen var dog i stand til at vokse og etablere sig, især hvor frøet udskiller exudater. Dette blev iagttaget ved, at der var en væsentlig forskel på vækst på de enkelte frødele, afspejlende de forskellige vækstbetingelser, der er til rådighed. En kolonisering på den synlige testa må forventes at være bæredygtig i forhold til beskyttelse, hvor spiringen af frøet foregår.

Der var ikke synlige hæmninger (eller forbedret coatning) ved anvendelse af et farvet bindemiddel, Sepiret der kan ”sladre” om fordelingen af antagonisten på frøet ved coatningen.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 November 2005, © Miljøstyrelsen.