Udvikling af funktionaliserede enzymer til selvpolerende skibs-bundmaling
1 Delrapport 1: Enzymudvikling og afprøvning på paneler
Baggrund
Iblandes enzymer i malinger baseret på organiske opløsnings midler er det tidligere vist at enzymerne udludes med en hastighed fra den tørre film der er for hurtig til at opnå begroningshæmmende effekter sidst på en sejlsæson.
Formål og aktiviteter
Konceptet for dette opfølgnings projekt har været at modificerer enzymerne ved kemisk at tilføje en ”hale” til disse så de hydrofobe egenskaber ved enzymerne er blevet ændret. ”Halen” der er påsat enzym molekylerne har lipofil karakter. Denne - derved ændrede egenskab ved enzymet - skulle gerne bevirke at effekten af enzym aktiviteten bevares i malingen i længere tid.
Arbejdet med disse modifikationer har været vanskeligt at gennemføre og taget meget længere tid end først antaget. Det har således ikke været muligt at få fremstillet tilstrækkelige mængder af modificeret enzym til at forsøgsbåde kunne males med disse prototyper af enzymmalinger.
Afprøvningerne er derfor foretaget på paneler der er samlede i et raft. Disse test paneler der har været malet med modificeret enzym er udsat i Helsingør Nordhavn og tilset gennem sejl sæsonen.
Parallelt har der været fremstillet maling baseret på umodificeret enzym - vandige og med organisk opløsningsmiddel i mængder så et antal lystbåde i udvalgte havne kunne males. Afprøvningen af disse malinger er udført i samarbejde med Dansk Sejlunion.
Modifikation og funktionalisering af enzymer
I samarbejde med CISMI, Roskilde Universitet er det lykkedes at fremstille modificerede enzymer, der er påsat polyethylenglycol (PEG) molekyler – ”haler”, uden at enzym aktiviteten er gået nævneværdig tabt. Derudover er det yderligere lykkedes at fremstille modificerede enzymer som kan iblandes organiske opløsningsmidler hvor den vandige andel af solvent er minimeret.
Modifikationen af enzym blev udført med to typer af PEG ”kædemodifier”. Den første er en PEG-mono octadecyl ether (short chain modifier) og den anden er en triblock co-polymer (long chain modifier). Begge kæder blev først aktiveret med DSC disuccinimidyl carbonate for at danne den aktive PEG-SC som blev bundet til enzym enten i PBS buffer eller i 10 % vand – 90 % Dowanol opløsning. Der blev i alt fremstillet 4 forskellige modificerede enzym prøver med de interne numre E483, E484, E485 og E486. Overordnet struktur på molekyle modifikationerne er angivet nedenfor.
Figur 1.1 - Overordnet struktur på molekylmodifikationerne.
Test af enzymaktivitet
Biolocus har udviklet en kvantitativ metode til at analysere enzymaktiviteten i våd maling.
På den tørre film er der udviklet et kvalitativt assay baseret på et lille peptid (N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide) forkortet suc-AAPF-pNA. Peptidet er i udgangspunkt farveløst, men når det spaltes af enzym skifter det straks farve til en gul farve. Intensiteten af den gule farve kan samtidig i nogen grad give et fingerpeg om mængden af enzym i filmen.
Test af maling på paneler udsat i Helsingør Nordhavn
Helsingør Nordhavn er valgt som test station grundet høj vandudskiftning og en saltkoncentration der er repræsentativ for de indre danske farvande. Erfaringsmæssigt er Helsingør Nordhavn også et område hvor begroningsintensiteten er høj og dermed velegnet som teststation.
12 paneler med forskellige enzymmalinger er udsat i Helsingør Nordhavn i maj måned på et såkaldt raft, dvs. en ramme, hvorpå panelerne er monteret. (se Foto 1.1). Raftet blev monteret på en tømmerflåde, således at overkanten var ca. 1 m under havoverfladen og eksponeret mod sydøst (se Foto 1.1).
De enkelte paneler er tilset én gang pr. måned frem til og med oktober måned hvor forsøget afsluttedes. Enzym malinger har således været eksponeret i alt 5 måneder svarende til en sejlsæson. Da panelerne er statiske kan de til dels sammenlignes med en båd som søsættes og ikke sejler i sæsonen.
De enkelte paneler er undersøgt for begroning – mængde og begronings art. Endvidere er filmoverflade undersøgt for blister og krakelering. Endelig er panelerne blevet fotograferede.
Foto 1.1 - Flere rafts samlet og monteret på en tømmerflåde.
Nedenfor (Tabel 1.1) er vist en oversigt over et udsat raft med indholdet af enzym maling på de enkelte paneler angivet.
Alle testede enzymer hører til gruppen subtilisiner som er serin proteaser. De forskellige koder for enzympræparationer skyldes de forskellige kemiske modifikationer af enzymerne, der tjener til at fasthæfte enzymerne bedre i malingen. De modificerede hedder 484 og 486 (fasthæftning i malingen). De andre angivelser med 8L m.fl. er kommercielle varianter, der bruges i både opløsningsmiddel- og vandbaserede malingsvarianter. Dog er alle AF formuleringerne opløsningsmiddelbaserede.
Tabel 1.1 - Oversigt over et raft med indholdet af enzymmaling på de enkelte paneler angivet.
| Panel # | Indhold | Farve |
| 1 | AF2156 | Hvid |
| 2 | AF2156 med biocider | Hvid |
| 3 | AF2156 + 5% Enzym S16L | Hvid |
| 4 | AF2156 + 5% Enzym E 8L | Hvid |
| 5 | AF2156 + 5% Enzym A 2,5L | Hvid |
| 6 | AF2156 + 10% Enzym A 2,5L | Hvid |
| 7 | AF2156 + 5% E484 | Hvid |
| 8 | AF2156 + 10% E484 | Hvid |
| 9 | AF2156 + 5% E486 | Hvid |
| 10 | AF2156 + 10% E486 | Hvid |
| 11 | CoatZyme | Blå |
| 12 | AF2156 med biocider | Blå |
Raftet er udsat i 1. maj og tilset én gang pr. måned i de efterfølgende fem måneder.
Foto 1.2 viser raftet før udsætning.
Foto 1.2 - Raft med 12 paneler før nedsænkning i havnen.
Som det fremgår, er der i alt 12 paneler på raftet. Panel indhold og nummereringen fremgår af tabel 1.1. Raftet aflæses fra venstre mod højre startende med panel # 1 i øverst række til venstre.
Resultater af test af malings forsøg på panel:
Foto 1.3 viser panelet efter at dette har været nedsænket i havnen i 5 måneder. Udviklingen af begroningen fra maj til oktober fremgår af bilag 1.
Foto 1.3 - Panel efter 5 måneder i vandet.
Konklusion - panelforsøg:
Som det fremgår af foto 1.3 er der kraftig begroning sidst på sæsonen i Helsingør Nordhavn idet rammen på raftet er totalt begroet. Begroningen er en blanding af bakterier (slim), kiselalger, samt – muslinger og rurer.
Base malingen uden tilsætning er ikke i sig selv i stand til at holde begroningen væk. Det ses af Foto 1.3 panel # 1. Kontrol panelerne (Panel # 2 og # 12) er base malingen tilsat toksiske biocider. De øvrige paneler (Panel # 3 til # 11) er alle enzym malinger med varierende mængde begroning. Begroningen består udelukkende af et bakterielt slim lag samt et lag af kiselalger (den brune belægning på panelerne).
Det kan således konkluderes, at enzym malingen i den nuværende form kan forhindre begroning af muslinger og rurer i en sejlsæson. Det er ikke entydigt hvorvidt modifikationen af enzymerne er en forbedring i forhold til umodificeret enzym idet base malingen sideløbende har undergået en optimering.
Både som er malet med enzymmaling:
De både, hvoraf nogle er stillet til rådighed gennem Dansk Sejlunion, er malet med enzymmaling uden modifikation af enzym. Enzymerne er tilsat andre formuleringer af maling end tidligere år herunder er en vandbaseret maling der er under afprøvning.
Dansk Sejlunion har stået for udlevering af malingen, inspektionen sæsonen igennem, indsamling af spørgeskemaer samt afrapporteringen. Her skal blot angives et eksempel samt gengive konklusionen fra delrapport 2.
Bådene der indgår i forsøget fremgår af Tabel 1.2.
Tabel 1.2 - Bådene der indgår i forsøget.
| Båd | Havn | Maling |
| Yngling | Horsens | Mark 5 + enzym A 2,5 L |
| Motorjolle | Horsens | Mark 5 + enzym A 2,5 L |
| Banner 28 | Marselisborg | Mark 5 + enzym A 2,5 L |
| LM-24 | Helsingør | Vandbaseret + enzym S16 L |
| IFér | Helsingør | Mark 5 + enzym A 2,5 L |
| Sundwind 27 | Humlebæk | Mark 5 + enzym A 2,5 L |
| Maxi Fenix | Vedbæk | 8-forskellige malinger |
Mark 5 er en opløsningsmiddel baseret, polerende maling, og der blev anvendt 5 % enzymopløsning i de prøver.
De fleste af bådene er søsat i maj eller begyndelse af juni. Næsten alle sejlere bemærker at enzymmalingen har dårlig dække evne og noget vanskelig at påføre. Bådene i Horsens er tilset første gang i juni. Et eksempel fremgår af Foto 1.4 nedenfor. En mere udførlig beskrivelse findes i delrapport 2.
Foto 1.4 - Båd, der er malet med enzymmaling. Striben, der ses gennem bund og køl, er malet med samme maling uden tilsætning af enzym.
Konklusion - testbåde
På baggrund af inspektionerne og bådejernes vurdering er følgende udsagn formuleret om de to enzymbaserede testbundmalinger:
Enzymbaseret testmaling Mark 5
- Begror med særdeles meget slim og alger.
- Testsejlerne observerede mere begroning i vandlinien end normalt.
- Testsejlerne oplevede gennem sæsonen en reduktion i bådens fart.
- Rurer forekommer kun i begrænset mængde på testmalingen. Dette gælder dog ikke i Horsens, hvor testbådene ved inspektion i august var dækket af rurer (50-100% af bundarealet).
- Afrensning af begroning har været nødvendig og er foretaget på hovedparten af testbådene.
- Der var kun ringe eller ingen forskel i begroningen på testmaling (med enzymer) og kontrolmaling (uden enzymer).
- Påføringsegenskaberne var ikke tilfredsstilende. Malingen var meget tyndtflydende og havde ringe dækkeevne.
Det konkluderes, at den enzymbaserede Mark 5 ikke virkningsmæssigt adskiller sig specielt fra standardproduktet uden enzymer. I sin nuværende formulering kan testmalingen ikke leve op til sejlernes behov for en rimeligt begroningsfri bund, der kan sikre manøvreringsevnen.
Enzymbaseret testmaling Vandbaseret base S 16L
Denne maling svarer til den, der er påført panel 11 på det afbildede raft fra Helsingør (og i tabel 1.1).
- Vandbaseret base med enzym har kun været afprøvet på en enkelt båd og grundlaget for udsagn vedr. denne malinger er derfor beskedent.
- Det var dog tydeligt, at båden med enzymmaling S 16 L var mindre begroet end øvrige testbåde (der lå i andre havne).
- Begroningen blev ikke vasket af i løbet af sæsonen og gav ikke anledning til uacceptable sejladsforhold for den pågældende ejer.
- Der var ingen forskel i begroningen på testmaling (med enzymer) og kontrolmaling (uden enzymer).
Det må konkluderes, at kendskabet til enzym maling S 16 L antibegroningsegenskaber er begrænset. Yderligere bådtest i en række forskelle havne vil derfor være nødvendig, før der siges noget generelt og mere fyldestgørende om denne malings virkning. Herunder vil det være essentielt med en grundigere undersøgelse af enzymernes effekt.
Version 1.0 Oktober 2007, © Miljøstyrelsen.