Fungiciders påvirkning af mykorrhizasvampes diversitet og funktion
6 Fungiciders indflydelse på forsøgsmarkernes naturlige mykorrhizasvampe-samfund
6.1 Formål
Det var formålet at undersøge effekten af fungicider på sammensætning og funktion af naturlige samfund af mykorrhizasvampe. Der blev anvendt jord fra to forskellige sædskifter og inden for hvert sædskifte blev jorden indsamlet som fire delprøver langs en 50 m transekt. Eksperimentet skulle teste hypotesen, at effekten af fungicider ville være større end effekten af dyrkningspraksis eller stedvariationen.
6.2 Eksperimentelt
Forsøget blev gennemført som et potteforsøg med de 24 behandlinger, der fremkommer ved at kombinere dyrkningspraksis, markprøver og fungicidbehandling som vist i Tabel 6.1. Der var 5 gentagelser for hver behandling og der blev i alt opstillet 120 potter.
Tabel 6.1. Design af eksperiment til undersøgelse af fungicideffekter på samfund af mykorrhizasvampe i markjord.
| Dyrkningspraksis | Markprøver | Fungicidbehandling (x markdosis) |
| 1. Økologisk Mark 29 2. Konventionel Mark 21 |
A B C D |
Mancozeb (1) Carbendazim (0,1) Ubehandlet |
Forsøgsjorden blev indsamlet langs 50 m transekter i mark 21 og mark 29 (M21 og M29), som er vist i Figur 2.1. Hvert transekt blev opdelt i fire afsnit á 12,5 m, og der blev udtaget delprøver i 12 tilfældigt placerede punkter i hvert afsnit; den mindste afstand mellem punkterne var 0,25 m. De 12 delprøver fra hvert afsnit blev slået sammen til én og dermed blev der indsamlet 4 prøver (A, B, C og D) fra hver mark. Hver af de 8 markprøver blev sigtet gennem et 5 mm trådnet og derefter blandet med en tilsvarende vægtmængde kvartssand (0,3 - 0,6 mm) for at sænke jordens P indhold og dermed opnå en øget mykorrhizaudvikling. Alle 8 blandinger blev tilført en fosfatfri gødningsblanding (Pearson & Jakobsen, 1993).
Hver prøve blev delt i tre portioner svarende til de tre fungicidbehandlinger, mancozeb (1 x markdosis eller 3,3 µg g-1 jord), carbendazim (0,1 x markdosis eller 0,06 µg g-1 jord) og ubehandlet. Beregning af markdosisækvivalenter er beskrevet i afsnit 5.1. De i alt 24 jordblandinger blev påfyldt potter uden afdræn med 1500 g jord i hver. Hver potte indeholdt et hyfe-indvækstkammer med jord, der var iblandet 5 kBq carrier-fri 33P g-1.
To ærteplanter (Solare) blev dyrket i hver potte og de i alt 120 potter blev placeret i et vækstkammer med 16 t lys ved 21°C og 8 t mørke ved 16°C. Potterne blev vandet efter behov til en vægt svarende til 65 % af vandkapaciteten.
Planter blev høstet efter 6 uger, og følgende variable blev målt: Plantebiomasse, mykorrhizadannelse i rødder, samt planternes indhold af 33P. Diversiteten af mykorrhizasvampe i rødderne blev bestemt på delprøver af rodsystemet fra hver potte. Prøverne blev opbevaret ved –20 °C og T-RFLP blev anvendt til at bestemme antal forskellige genotyper af mykorrhizasvampe. DNA blev ekstraheret fra samtlige rodprøver, og generne som koder for den lille ribosomale subunit (SSU-rDNA) blev mangfoldiggjort vha. PCR og mykorrhizaspecifikke primere. Prøverne blev oprenset og skåret med to restriktionsenzymer, TAQ og SAU. Fragmenterne blev mærket med en fluoriserende primer og blev kørt på en ABI 377 sekvenator. Fragmenternes størrelse (længde) og intensitet blev målt. De blev derefter sammenlignet med fragmentlængder hos alle registrerede mykorrhizasvampe for at eliminere fragmenter, der ikke kunne identificeres.
Forekomsten af arter blev registreret for hver gentagelse og derefter analyseret med en principal komponent analyse (PCA). Diversiteten blev beregnet som Shannon diversitets indeks for de to marker og for de tre fungicidbehandlinger.
6.3 Resultater
Planter fra konventionelt dyrket jord (M21) havde 5-10 % større biomasse end de tilsvarende planter fra økologisk dyrket jord (P = 0,08; data ikke vist). Denne forskel var lavere end forventet på baggrund af forskelle i jorden fosforindhold som er 25 og 45 mg P kg-1 i ublandet jord fra henholdsvis den økologisk og den konventionelt dyrkede mark. Den begrænsede forskel i væksten mellem de to marker skyldes formodentlig at mykorrhiza udbalancerede en negativ effekt af et lavt P niveau. Mellem 25 og 40 % af rodlængden havde udviklet mykorrhiza, og kolonisering var signifikant højest (P<0,0001) i jord fra den økologiske mark med det laveste P indhold (Figur 6.1, M29). Koloniseringen varierede også mellem delprøver inden for både mark 21 og mark 29 (P<0,05). Der var en signifikant interaktion mellem delprøve og fungicidbehandling i mark 21 (P<0,05); det tilsvarende signifikansniveau for mark 29 var P=0,052.
Figur 6.1. Mykorrhizaudvikling i rødder hos Solare-ært dyrket 6 uger i jord fra det konventionelle (M21) og det økologiske sædskifte (M29) ved Snubbekorsgaard. A, B, C og D angiver fire forskellige prøver langs transekter. Søjler angiver den procentvise andel af rodlængden som var koloniseret af mykorrhizasvampe.
Mykorrhizadannelsen er noget lavere end de maksimumværdier på 60-70 %, der tidligere er rapporteret i markforsøg med ært i det økologiske sædskifte (Schweiger et al., 2001; Bodker et al., 2002). I nærværende projekt er koloniseringen tilsvarende blevet målt på ærterødder indsamlet langs de to transekter i juli 2003. Disse rødder udviste en kolonisering på hhv. 62 % og 46 % i det konventionelle og det økologiske sædskifte. Disse data følger ikke det forventede mønster med den kraftigste kolonisering i jorden med det laveste P niveau, men forskelle i sædskifter og jordbehandling kan have spillet en rolle. Der var en tendens til, at fungicidbehandling øgede koloniseringen i det økologiske sædskifte og reducerede koloniseringen i det konventionelle. Disse forskelle var dog ikke signifikante. Derimod varierede koloniseringen signifikant mellem de fire deltransekter (A – D) i hver mark (P<0,001). Denne variation skyldtes ikke forskelle i jordens fosfatindhold og årsagen er ikke identificeret.
Figur 6.2. 33P indhold i Solare-ært dyrket 6 uger i jord fra det konventionelle og det økologiske sædskifte ved Snubbekorsgaard.
Det var hensigten at forsøg 2 skulle give information om fungicidernes betydning for mykorrhizasvampenes optagelse af P fra jord til plante. Hertil blev der anvendt et 33P-mærket jordvolumen som var adskilt fra resten af jorden vha. et 25µm nylon net. Svampehyfer, men ikke rødder, kan vokse igennem nettet og derved få adgang til den radioaktive fosfor. Planterne indeholdt overraskende små mængder 33P, formodentlig pga. en begrænset hyfeindvækst inden for de 6 ugers vækstperiode (Figur 6.2); de små 33P værdier skal vurderes på baggrund af en samlet tilførsel på 110 kBq pr. potte. De lave værdier for optagelse af 33P er behæftet med store standardfejl på middelværdier, og der kan ikke udledes nogen signifikant effekt af fungicidbehandling. Derimod var der en signifikant forskel i 33P optagelse mellem de to marker (P<0,05).
Sammensætning af svampesamfundet i rødderne er analyseret vha. T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), som er baseret på ekstraktion af rDNA og derefter PCR amplificering ved anvendelse af en terminalt placeret fluorescerende primer. PCR produktet skæres derefter med restriktionsenzymer. Som følge af sekvensvariation, vil det terminale restriktions-site være forskelligt for hver art i samfundet. Det digitale output giver oplysning om produktets længde i form af basepar (f. eks. for en art) og intensiteten af fluorescenssignalerne er et mål for hyppigheden af arterne i samfundet.
For at fjerne mulige falske mykorrhizasekvenser fra analyserne, blev samtlige kendte sekvenser af SSU rDNA samlet og på computer skåret med de to restriktionsenzymer. De resulterende fragmenter blev samlet i en database. Kun de fundne fragmenter som havde samme længde som sekvenser i databasen blev anvendt til PCA og til udregning af diversitetsindeks.
For yderligere at bekræfte forskellen mellem betydningen af dyrkningspraksis: økologisk og konventionel, markens heterogenitet og fungicidbehandling, blev det yderligere undersøgt, om forskellene kunne bekræftes på baggrund af tilstedeværelsen af kendte svampe. Dertil blev LSU rDNA fra prøverne amplificeret, og PCR produkterne derefter klonet og sekvenseret. Dette er meget arbejdskrævende og kostbart, blev kun få af prøverne blev derfor analyseret.
Figur 6.3. PCA på T-RFLP data efter skæring med restriktions-enzymet TAQ. Punkter fra de to marker er samlet. Mark 29 er linie-skraveret og mark 21 er prikket. Cirkler er med carbendazin, trekanter med mancoceb og firkanter er ubehandlede. Bogstaverne henviser til delprøve langs transektet.
PCA analyserne på T-RFLP data viste at det der primært grupperede data var hvilken mark prøverne var taget fra. Dette var tilfældet med begge restriktionsenzymer (Figur 6.3, TAQ og 6.4 (SAU). Den næste faktor som skiller data er svær at vurdere, men der er ikke noget der tyder på at fungicidbehandlingen skulle have større betydning end den heterogenitet, der findes inden for marken. Især når PCA blev udført med fragmenter skåret med TAQ, var punkter fra samme plot grupperer tættere sammen end punkter fra samme fungicidbehandling (Figur 6.3).
Figur 6.4. PCA på T-RFLP data efter skæring med restriktions-enzymet SAU. Punkter fra de to marker er samlet. Mark 29 er linie-skraveret og mark 21 er prikket. Cirkler er med carbendazin, trekanter med mancozeb og firkanter er ubehandlede. Bogstaverne henviser til delprøve langs transektet.
Resultaterne kunne bekræftes ved at amplificere og klone DNA direkte fra prøverne. Også her viste det sig også at markerne betød mest for fordelingen af arterne (Figur 6.5).
Figur 6.5. PCA af diversitets data opnået ved PCR, kloning og sekvensering af LSU rDNA. Mørk gråtone indeholder data fra mark 29, lys gråtone fra mark 21.
Figur 6.6. Diversitetsindeks udregnet på baggrund af T-RFLP data. Øverst udregnet for fragmenter skåret med TAQ og nederst skåret med SAU.
Diversiteten af mykorrhizasvampe i de to marken viste sig at være forskellig, idet der var en højere diversitet i den økologiske mark (Figur 6.6). Diversiteten blev ikke påvirket af fungicidbehandlingen. Der blev opnået de samme resultater uanset hvilket restriktionsenzym der blev anvendt. Resultaterne bekræfter PCA analyserne, idet forskellen mellem markerne giver de største forskelle, mens fungicidbehandlingens betydning ikke var målbar.
Samlende viste undersøgelserne, at der var stor forskel på de to marker, og at disse forskelle også gjaldt svampesamfundets sammensætning. Denne forskel i samfundenes sammensætning forklarer også den målte forskel i mykorrhizaudvikling og fosforoptagelse. Prøverne blev indsamlet langs et 50 m transekt, og det var interessant, at der var en betydelig variation indenfor markerne, både hvad angik mykorrhizakolonisering og fosforoptagelse. Dette blev også afsløret af PCA-analyserne, hvor punkter fra samme plot i transektet lå tæt sammen. Fungicid behandlingen havde kun lille effekt på svampesamfundene, og det var også svært at se en generel effekt af fungicider på kolonisering og fosforoptagelsen. Konkluderende kan vi sige at dyrkningspraksis er afgørende for svampesamfundets sammensætning og funktion, mens effekten af fungicid behandling vil være mindre end sted-variationen i marken.
Version 1.0 September 2006, © Miljøstyrelsen.