Fungiciders påvirkning af mykorrhizasvampes diversitet og funktion
5 Fungiciders indflydelse på funktion af mykorrhiza baseret på rekonstruerede svampesamfund
5.1 Formål
Det var formålet at undersøge fungiciders effekt på kolonisering og fosfatoptagelse for de fire mulige kombinationer af tre mykorrhizasvampe isoleret fra det økologiske sædskifte; hver af de fire kombinationer blev sammenlignet med behandlinger, hvor svampene forekommer enkeltvis. Eksperimentet blev designet til test af følgende hypotese: Fungicider påvirker ikke blot funktionen af mykorrhizasvampe i monokultur, men kan også forskyde balancen i kombinationer af to eller tre svampe og dermed også sammensætning og funktion af marksamfund.
5.2 Eksperimentelt
Forsøget blev gennemført som vist i Tabel 5.1. Der blev anvendt 0,5 x markdosis af mancozeb og carbendazim ligesom i afsnit 5.2 To ekstra carbendazim-behandlinger (0,1 x og 1 x markdosis) blev inddraget med henblik på at konstruere responskurve for carbendazim og dermed opnå en kontrol af testsystemets funktion.
Tabel 5.1. Design af faktorielt eksperiment til undersøgelse af fungiciders effekt på enkeltkulturer og blandinger af tre mykorrhizasvampe. Hver af de otte svampebehandlinger var kombineret med de tre fungicidbehandlinger
| Svampeart (mark 29) | Mykorrhiza-inokulum (g potte-1) | Fungicid |
| A | 150 | 0,5x Carbendazim |
| B | 150 | 0,5x Mancozeb |
| C | 150 | Ubehandlet |
| AB | 75+75 | |
| AC | 75+75 | |
| BC | 75+75 | |
| ABC | 50+50+50 | |
| NM | 0 | |
| B | 150 | 0,1x Carbendazim |
| B | 150 | 1x Carbendazim |
De anvendte svampe er isoleret fra det økologiske sædskifte (mark 29, Snubbekorsgaard). A og B er Glomus mosseae (hhv. kultur nr. L 541, BEG84 og kultur nr. L 545, BEG85) og C er G. caledonium (kultur nr. L 554, BEG86). Den forudgående kvalitetstest af inokulum viste at A, B, og C havde koloniseret hhv. 64, 61 og 54 % af den totale rodlængde hos jordkløver-testplanterne. Der blev anvendt samme mængde inokulum af hver svamp og den totale mængde inokulum var ens i alle mykorrhizabehandlinger.
Forsøgsjorden var en 1:1 blanding (vægt/vægt) af Rørrendegård-jord og kvartssand, som var elektronstråle-bestrålet (10 MeV, 15 kGy) og derefter iblandet næringsstoffer (Pearson & Jakobsen, 1993). Rørrendegård er naboejendom til Snubbekorsgård, og jordtypen er den samme, men indholdet af plantetilgængeligt P er lavere i den anvendte Rørrendegård-jord.
Jorden blev påfyldt 1.5 L potter indeholdende et rodfrit mycelie-indvækstkammer i form af et 50 mL plastrør, hvor begge åbninger var lukket med et nylon net med 25 µm maskestørrelse. Kammeret var fyldt med 59 g jord mærket med 3.5 kBq carrier-fri 33PO4 g-1. Med fem gentagelser af hver behandling, blev der opstillet 130 potter i vækstkammer med 16 t lys ved 21 °C og 8 t mørke ved 16 °C. Potter med to ærteplanter (Solare) i hver blev vandet til 65 % af vandkapaciteten og blev gødet med 4 x 50 mg N i form af en NH4NO3-opløsning i løbet af vækstperioden. Forsøget blev høstet 56 dage efter såning og følgende variable blev målt: Plantebiomasse, mykorrhizadannelse i rødder, længde af hyfer i 33P-mærket jord samt planternes indhold af 33P og totalt P.
I behandlinger med mere end én svamp blev de enkelte svampe kvantificeret ved at amplificere LSU-rDNA fra rodprøver med specifikke primere. PCR prøverne blev derefter analyseret med SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) for at kunne adskille de tre svampe (Kjøller & Rosendahl 2000a). Svampene blev rangeret på skalaen 0, 1 eller 2 i forhold til SSCP-båndenes intensitet. De enkelte svampes bidrag til den samlede kolonisering blev derefter beregnet (se tekst til Figur 5.2).
5.3 Resultater
5.3.1 Vekselvirkning mellem svampe i fravær af fungicider
De tre svampe koloniserede ærteplanternes rødder i forskelligt omfang, når de var hver for sig. Mere end 50 % af rodlængden havde udviklet mykorrhiza i planter podet alene med svamp C (G. caledonium), medens podning med G. mosseae svampene (A eller B) førte til koloniseringsniveauer på kun omkring 13 % (Figur 5.1). Denne overraskende afvigelse fra de forventede koloniseringsniveauer, baseret på data for kvalitetskontrol af inokulum, skal formodentlig forklares ved en vis grad af vært-svamp præference mykorrhiza-symbiosen (Helgason et al., 2002).
Tilsyneladende eksisterede der en gunstig vekselvirkning mellem A og B, således at de to svampe i forening koloniserede en større andel af rodlængden end når svampene var alene. Idet inokulummængder var halveret, hvor svampene blev blandet to og to, må dette resultat skyldes en vekselvirkning i en eller flere af de signal-pathways, der er involveret i mykorrhizadannelsen. Den positive vekselvirkning mellem A og B førte til en fordobling af hyfelængden og en tredobling af myceliets 33P optagelse (Figur 5.1). Kvantificeringen af de enkelte svampe i kombinations-behandlingerne tyder på, at svamp A bliver stimuleret når den kombineres med svamp B, og i særdeleshed i kombination med svamp C (Figur 5.2, ubehandlet). Kombinationer af svamp A og B med svamp C førte til en svag reduktion i kolonisering af rødderne i forhold til behandlingen med svamp C alene (Figur 5.1). Dette kunne skyldes en fortynding af C-inokulum med de svagere A- og/eller B-inokula. Den PCR-baserede kvantificering af de enkelte svampe tyder dog på en egentlig hæmning af svamp C, når A og/eller B var til stede samtidig (Figur 5.2, ubehandlet). En hæmning af svamp C induceret af svamp A og/eller svamp B er i overensstemmelse med, at både hyfelængde og 33P optagelse var lavere i kombinationer med C, end hvor C var alene (Figur 5.1). Planter uden tilførsel af inokulum af mykorrhizasvampe udviklede ikke mykorrhiza.
Figur 5.1. Effekt af mancozeb og carbendazim på tre mykorrhizasvampes kolonisering af ærterødder og af jord samt på svampenes 33P-optagelse. Rodkolonisering er målt ved mikroskopi af farvede rodprøver. Svampene var til stede enkeltvis (A, B og C) eller i kombination (AB, AC, BC, ABC) og den anvendte mængde inokulum var ens i de syv behandlinger. Én behandling modtog ikke svampeinokulum (NM). Middelværdier og standardfejl er vist.
5.3.2 Fungicideffekter på vekselvirkning mellem mykorrhizasvampe
Fungicidernes indflydelse på mykorrhizasvampenes vækst og 33P optagelse varierede betydeligt mellem de forskellige svampebehandlinger. Mancozeb stimulerede rodkoloniseringen i C, AC og ABC behandlingerne, medens en modsat rettet tendens kunne ses i A behandlingen (Figur 5.1). Hyfelængder og 33P optagelser hos A og B behandlingerne er vanskelige at tolke, idet værdier har samme niveau som målt hos planter uden mykorrhiza. Imidlertid havde manzoceb en negativ effekt på hyfelængden i alle 4 behandlinger med C svampen. Hvor C var kombineret med de to andre svampe var hyfelængden fordoblet i mancozeb-behandlingen, som dog havde en negativ effekt, hvor svamp C var alene.
Figur 5.2. Forekomst af de tre svampe A (skraverede søjler), B (åbne søjler) og C (sorte søjler) i forsøg med mere end én svamp. Bidraget til mykorrhizadannelse (% af rodlængde) fra den enkelte svamp er beregnet på baggrund af total rodkolonisering (Figur 5.1) og den relative intensitet af de genetiske markører.
En samlet vurdering af effekter på hyfelængder og rodkolonisering tyder på, at mancozeb havde en modsatrettet effekt på det rodeksterne og det rodinterne mycelium (Figur 5.1). Mancozeb forøgede 33P optagelsen meget tydeligt i alle fire C-behandlinger: Optagelsen blev fordoblet, hvor C var den eneste svamp, tredoblet i BC kombinationen og næsten firedoblet i AC og ABC kombinationerne (Figur 5.1).
Behandling med mancozeb medførte, at balancen mellem A og C blev ændret, således at svamp C klarede sig væsentlig bedre end i tilsvarende kombinationer uden fungicidtilførsel (Figur 5.2, mancozeb). Behandling med carbendazim ændrede derimod ikke på svampenes indbyrdes hyppighed i forhold til i ubehandlet jord (Figur 5.2, carbendazim og ubehandlet). Data for P optagelsen viser, at kombinationer med svamp C havde en lavere P optagelse, end når svamp C var alene (Figur 5.1). Denne negative effekt af kombinationerne på svampenes P optagelse blev tydeligvis modvirket af mancozeb. Dette skyldes sandsynligvis at mancozeb øger svamp C’s andel af koloniseringen (Figur 5.2). Dette underbygges af, at hyfelængden i fravær af fungicider var mindre i kombinationer med svamp C, end når svamp C var alene; det omvendte forhold gjorde sig gældende i behandlinger med mancozeb, hvor den største hyfelængde blev målt i kombinationerne (Figur 5.1).
Effekten af carbendazim på rodkolonisering var begrænset til en svag stimulering i AC behandlingen, medens hyfelængden blev stimuleret i behandlinger med svamp C. Ligesom mancozeb, havde carbendazim en kraftig positiv virkning på 33P optagelsen i behandlinger omfattende C svampen. De kraftigste effekter, op til tre ganges forøgelse, blev opnået i AC og ABC kombinationerne. Sammenligner man de enkelte svampes kolonisering, ses det at svamp C ikke klarer sig godt i konkurrencen med svamp A, men at balancen mellem svamp A og svamp C svarer til hvad man ser i ubehandlede planter (Figur 5.2). Dvs at stimuleringen ikke kan forklares som en stimulering af svamp C, som har vist sig at øge planternes fosfor- optagelse, men må tilskrives hormesis-effekter som beskrevet i kapitel 4.
5.3.3 Effekter på plantevækst samt dosis-respons forløb for Glomus mosseae
Plantebiomassen varierede i området 10 – 12 g tør vægt pr potte. Den mindste vækst blev opnået i behandlinger med alene A eller B svampen, medens de største planter blev høstet i potter uden mykorrhizapodning samt i C og AB behandlingerne (data ikke vist). Der blev observeret en tendens til vækstreduktion i fungicidbehandlede A, B og AB potter. Glomus mosseae svampen ”B” blev anvendt til test af modelsystemets funktion. Valget var ikke ideelt pga. det lave koloniseringsniveau i fravær af fungicid. Imidlertid viser dosis-respons kurverne, at testsystemet fungerede som forventet, idet både 0,1 og 0,5 x markdosis resulterede i en tydeligt forøget rodkolonisering, hvor 1 x markdosis førte til en svag reduktion (Figur 5.3). Uden fungicid afviger hyfelængde og 33P optagelse ikke fra værdier opnået uden mykorrhiza (Se Figurer 5.1 og 5.3), men 0,1 x markdosis carbendazim resulterer i en stimulering af begge variable. Dette hormesis-lignende responsmønster er i overensstemmelse med resultaterne beskrevet i afsnit 4.1, 4.2 samt i dette afsnit.
Figur 5.3. Dosis-respons for carbendazim effekter på rodkolonisering, hyfelængde og 33P optagelse hos G. mosseae ”B” i symbiose med Solare-ært.
5.4 Diskussion
Forsøget viste, at effekten af flere mykorrhizasvampe på fosforoptagelsen ikke kunne forudsiges ud fra de enkelte svampes effekt på fosforoptagelsen. Dette skyldes sandsynligvis, at der er en konkurrence mellem svampene, samtidig med at svampene også kan påvirke hinanden positivt. Konkurrence mellem AM svampe er tidligere vist ved at anvende protein (enzym) markører, hvor det blev vist at visse svampe kan udelukke andre svampe fra rodsystemet (Hepper et al., 1988).
Fungicideffekter på mykorrhizasvampe enkeltvis og i blanding er tidligere blevet undersøgt, og resultaterne viste en større fungicidtolerance når svampene var i blanding end når de forekom enkeltvis (Schreiner & Bethlenfalvay, 1997). De anvendte doser var dog ~50 x højere end markdosis og derfor ikke realistiske. Stimulerende effekter er tidligere blevet påvist af anbefalede doser carbendazim og en fenrpopimorph – propiconazol blanding (Schweiger et al., 2001) samt anbefalede doser af metalaxyl (Groth & Martinson, 1983).
Begge fungicider havde en begrænset indflydelse på mykorrhizasvampenes totale kolonisering af ærterødderne. Mancozeb havde dog en effekt på konkurrencen og samspillet mellem de enkelte svampe. I de fleste tilfælde var der tale om en fungicid-induceret stimulering af svampenes aktivitet. En del af denne effekt kunne forklares som en forskydning mellem de enkelte svampes rodkolonisering. Dette resultat bekræfter hypotesen om, at fungicider kan påvirke sammensætningen af mykorrhizasvampe samfund. Både carbendazim- og især mancozeb- behandlingerne resulterede her i en højere fosforoptagelse, men dette bør ikke tolkes som et generelt billede på effekter af fungicidbehandling på mykorrhizasvampe, idet svampenes indbyrdes samspil vil have stor betydning for udfaldet.
Version 1.0 September 2006, © Miljøstyrelsen.