Statistisk analyse og biologisk tolkning af toksicitetsdata
10 To-generationsreproduktions-forsøg
10.1 Problemstilling
Reproduktionsforsøg udføres for at undersøge, hvorvidt et stof er toksisk i relation til forplantning. Sædvanligvis gennemføres forsøget over to generationer, hvor stoffet hele tiden administreres til forældre/afkom i tre forskellige dosisgrupper og en kontrol. Under forsøgsperioden måles forskellige variable som f.eks. kuldstørrelse for 4 forskellige doseringer, hvoraf en er kontrolgruppen, Ud fra data fastlægges en No Observable Effect Level (NOEL), ED10 eller en Benchmark Dose (BMD). I litteraturen findes der flere definitioner af BMD, men her vil vi holde os til den givet i (Crump, 2002), som kort beskrives i det følgende. Vi betegner responsvariablen med Y og dosis-responsfunktionen med μ(x). Endelig lader vi P0 være sandsynligheden for uønsket respons ved dosis 0. Denne sandsynlighed sættes typisk til 5%. BMD er da den dosis x*, der giver en forøget risiko svarende til en fastlagt Benchmark Risk (BMR) set i forhold tilP0:
BMR sættes typisk til 5%. Dette fører til at BMD er den dosering x*, der er fastlagt ud fra ligningen
hvor funktionen µ er defineret ovenfor, mens Φ-1 betegner den inverse funktion af fordelingsfunktionen for en standard normalfordeling. Den nedre 95%-konfidensgrænse for BMD benævnes BMDL, og denne angives typisk ved en risikovurdering.
10.1.1 Kuldstørrelse
Her gives et eksempel med stoffet XL. Forsøget blev udført som et 2-generations forsøg med 26 kuld i hver af de 4 dosis grupper (0, 10, 30 og 100 mg/kg/dag). Forældredyr (første generation) blev fodret med stoffet i 10 uger før parring, under parringsperioden, drægtighed og laktation indtil aflivning. Anden generation blev eksponeret på tilsvarende måde. Der blev målt en række variable herunder kuldstørrelse (antal unger ved fødsel).
NOEL-tilgang
I Figur 10.1 er de mest interessante forskelle dem mellem dosis 0 og de andre doseringer, og det fremgår tydeligt, at der er forskel mellem dosis 100 og 0 i første generation, mens der ikke er forskel mellem doseringer i anden generation. I en klassisk toksikologisk vurdering konkluderes der derfor, at kuldstørrelsen er signifikant reduceret i 100 mg/kg/dag gruppen i forhold til kontrol gruppen i første generation, men ikke i anden generation, mens 30 mg/kg/dag gruppen ikke er forskellig fra kontrolgruppe. NOEL vil derfor blive sat til 30 mg/kg/dag.
Figur 10.1. Resultat af en variansanalyse for hver af de to generationer. Grafen viser forskelle i kuldstørrelse (x-akse) og tilhørende 95%-konfidensintervaller mellem de enkelte doseringer (parvise sammenligninger). Hvis intervallerne indeholder 0, er der ingen forskel på de tilhørende 2 doseringer.
Dosis-responsanalyse
Ved at benytte en tre-parameter log-logistisk model, hvor den logaritme-transformerede ED50 indgår som parameter (se afsnit 4.1), fik vi en øvre grænse på kuldstørrelsen for første og anden generation på henholdsvis 12 (0,5) og 10 (0,7) dyr/kuld. Figur 10.2 viser, at de estimerede dosis-responsmodeller giver en ganske rimelig beskrivelse af data, og i begge tilfælde understøttes dette indtryk af ikke-signifikante lack-of-fit-tests.
Figur 10.2. Kuldstørrelse (dyr/kuld) ved fødsel som funktion af dosis af stoffet XL. Vi har brugt en tre-parameter log-logistisk model (Ligning (2.1b)). Første generation er den fuld optrukne linje og anden generation den stiplede linje.
Som det ses i Tabel. 10.1 er de estimerede ED-værdier for første generation omtrent en faktor 2 mindre end de tilsvarende estimater for anden generation. Ved at sammenligne ED50 i Tabel 10.1 med det faktiske doseringsområde, ses at de estimerede ED50 for begge generationer ligger uden for doseringsområdet, men det afspejler sig også direkte i konfidensintervallerne for ED50, som er meget brede.
Tabel 10.1. ED-estimater med tilhørende 95%-konfidensintervaller for de to generationer, baseret på dosis-responsmodellerne vist i Figur 10.1.
| 95%-konfidensinterval | |||
| ED- niveau | (mg/kg/dag) | Nedre | Øvre |
| Første generation | |||
| 10 | 23 | 4 | 130 |
| 20 | 64 | 27 | 151 |
| 50 | 368 | 75 | 1815 |
| Anden generation | |||
| 10 | 42 | 5 | 381 |
| 20 | 120 | 31 | 473 |
| 50 | 732 | 20 | 26279 |
For både første og anden generation ligger de estimerede ED10-værdier ikke langt fra den estimerede NOEL på 30.
Benchmark dose-proceduren
Ved at bruge den ovenfor beskrevne metode for beregning af BMD fås, at BMD er 18 med tilhørende BMDL på 4 for første generation. For anden generation fås BMD til at være 70 med en tilhørende BMDL på 17. For anden generation afviger BMDL-værdien noget fra nedre grænse i 95%-konfidensintervallet for ED10 baseret på dosis-responsanalysen, mens de tilsvarende værdier er ens for første generation.
10.1.2 Afsluttende bemærkninger
Ovennævnte assays er særdeles bekostelige og derfor vil man økonomisere med de administrerede doser. Traditionen er at anvende variansanalyser og undersøge signifikante forskelle mellem effekter ved forskellige doseringer i relation til kontrolgruppen (NOEL). Ved brug af dosis-responsanalyser er det muligt at udregne ED10 og dermed få et mere brugbart estimat, der ikke nødvendigvis er betinget af de valgte doser.
Version 1.0 Oktober 2008, © Miljøstyrelsen.