Miljøprojekt, 910 – Substitution af biocider i bundmaling til skibe med enzymer – Bilag A Undersøgelse af enzymers evne til at nedbryde cypriders klæbestoffer

Substitution af biocider i bundmaling til skibe med enzymer

Bilag A

Undersøgelse af enzymers evne til at nedbryde cypriders klæbestoffer

Undersøgelserne der er udført hos TNO kan sammenfattes som følger:

Eksperiment 1

Tre forskellige protease præparater blev testet i koncentrations-området 10 – 1000 ug enzym/ml. De testede præparater var Alcalase, SP-234 og SP-249 alle leveret af Novozymes A/S (Novo Allé, 2880 Bagsvaerd, Denmark). SP 234 og SP 249 er eksperimentelle præparater med et højt indhold af proteolytisk aktivitet samt andre ikke proteolytiske enzymaktiviteter. Alcalase er en kommerciel protease som blandt andet anvendes i vaskepulver.

Testen blev udført i fire dobbelt bestemmelser i polystyren “multi well (2x3)” plader fra Steriline Ltd. Mellem 25 – 40 cyprider blev tilsat (med en Pasteur pipette) til brøndene som indeholdt 2 ml filtreret havvand (kontrol) eller enzymopløsning. Test opløsningerne blev fremstillet ved direkte at opløse enzymerne i sterilfiltreret ”naturligt” havvand. Pladerne blev inkuberet 24 timer ved en temperatur på 27 +/- 1 °C og med en 15:9 lys-mørke cyklus . Efter inkubation blev cypriderne screenet for tegn på toksiske effekter ved anvendelse af mikroskop. Testen blev afsluttet ved tilsætning af en dråbe 40% formaldehyd og antallet af permanente og ikke fasthæftede larver blev talt.

Tabel A1. Cyprid fasthæftning
Dose (µg/ml)	10	50	100	500	1000
Kontrol	80%	80%	80%	80%	80%
Alcalase	50%	0%	0%	0%	0%
SP 234	85%	88%	75%	10%	0%
SP 249	50%	70%	40%	20%	20%

Tabel A1 viser resultaterne og det fremgår heraf at det kommercielle enzym Alcalase er i stand til at hindre 100% fasthæftning ved en koncentration på 50 - 1000 ug/ml.

De to SP præparater var ikke så effektive som Alcalasen.

Eksperiment 2

For yderligere at undersøge enzymernes effektivitet blev et forsøg med sammenligning af protease aktiviteterne sat op. Enzympræparaterne indeholdt proteaser målt ved hjælp af HUT - aktivitet. (HUT: Haemoglobin Units on Tyrosine basis). HUT aktiviteten af proteaserne kan bestemmes som beskrevet i f.eks. (Food Chemicals, 1981).

Enzym præparaterne indeholdt følgende protease aktivitet:

Alcalase: ca. 1,300,000 HUT/g
SP 234: ca. 500,000 HUT/g
SP 249: ca. 600 HUT/g

Alle enzymerne blev testet ved koncentrationer svarende til 6000 HUT/l og 60000 HUT/l og fasthæftningens assayet blev anvendt som beskrevet ovenfor.

Tabel A2
Treatment	HUT/l	ppm (µg/ml)	% Cyprid settlement	G-test (ns= not significant)
Control	0	0	63	-
Alcalase	6,000 60,00 0	4.6 46	34 0.8	19.37; p<0.005 124.1; p<<0.005
SP 234	6,000 60,00 0	12 120	62 52	0.005; ns 2.665; ns
SP 249	6,000 60,00 0	1,000 10,000	52 0	2.702; ns 134.6; p<<0.005

Det ses tydeligt af tabel A2, at Alcalase signifikant forhindrer fasthæftelse ved 6000 HUT/l (4.6 ppm), og fuldstændigt forhindrer fasthæftelse ved 60,000 HUT/l (46 ppm).

SP234 har ingen signifikant indvirkning på fasthæftningen både ved 6.000 HUT/l and 60,000 HUT/l. SP 249 forhindrer fuldstændigt fasthæftningen ved 60,000 HUT/l mens der ikke er nogen signifikant indvirkning ved 6,000 HUT/l.

I alle opløsningerne – undtaget SP249 ved 6000 HUT/l – så cypriderne ”raske” ud efter 24 timers inkubation hvilket indikerer en non-toksisk karakter af opløsningerne. I SP249 var larverne stadig i live i 6000 HUT/l opløsningen, men de udviste ikke normal svømmebevægelse og fasthæftnings adfærd.

For en nærmere beskrivelse af resultaterne se (TNO-report, 1994)