| Front page | | Contents | | Previous | | Next |

In Vivo Investigation of Dietary Exposure to 5 Pesticides

4 Materialer og metoder

4.1 Test- og kontrolstof

Chlorpyrifos (CH), CAS nummer 002921-88-2.Bromopropylat (BR), GS19851A, technical, P.408159, 92.50% (Novartis).

Alfacypermethrin (AL), CAS nummer 67375-30-8. Carbendazim (CB), technical, Hoe 017411 00 ZD99 0028 (AgrEvo code). Mancozeb (MA), CAS nummer 8018-01-7.

CH , BR, AL, CB og MA blev samlet iblandet pulveriseret chowfoder (Al-tromin), der blev slået til pellets, i koncentrationer, der for de enkelte stoffer svarede til 1/5 af NOAEL, NOAEL og 5 gange NOAEL (NOAEL er den højeste dosis for de respektive stoffer fundet i 90-dagesforsøg i rotter, der ikke gav toksikologisk effekt (Kilde er JMPR-monografier (BR)samt MST-vurderinger). Ved håndtering af teststoffer herunder ved fremstilling af foder blev det pålagt at bære handsker og støvmaske. Det blev foreskrevet at foder-blanding skal foregå under udsugning m.h.p. at reducere udsættelse for støv-partikler.

Foderet blev fremstillet af Altromin International, Tyskland. Tetstofferne opbevares på køl hos Altromin International, Tyskland. Relavante dokumenter vedr. sikerhedsforanstaltninger ved håndtering samt specifikation mm., der blev modtaget sammen med de enkelte teststoffer blev medsendt.

4.2 Dyr

Dyreart, stamme og sygdomsstatus: Rotte/ MOL: Wist (Hannover), SPF. (Begrundelse: Instituttet har erfaring med denne Wistar rotte).

Antal: 48

Køn: 24 han og 24 hun.

Alder/vægt ved ankomst: Ca. 4 uger

(ca 45-55 gram. Vægten 3 dage efter ankomst lå imellem 60g og 73g for hannerne og imellem 53g og 66g for hunnerne)

Leverandør: M & B A/S, Tornbjergvej 40, Ejby, 4623 Ll. Skensved, Danmark.

Dyreværn/-etik: Se under 6.7.

4.3 Modtagelse, randomisering og mærkning af dyr

Dyrene blev randomiseret på hold (jf. holdopstilling), 6 dyr/køn/hold, således at den gennemsnitlige legemsvægt og spredning var sammenlignelige holdene imellem (IT/DYR/GNAV/08). Dyrene blev øremærket i henhold til IT/DYR/GNAV/011. Desuden blev rotten med det højeste dyrenummer i hvert bur mærket med et tusch mærke på halen.

4.4 Opstaldning af forsøgsdyr

Rumnr.: E 220

Burtype: Trådbure (de første dage dog i makrolombure) type III med træklods, 2 dyr af samme køn pr. bur.

Miljø: Rumtemperatur blev sat til 21 + 1⁰C.

Luftfugtighed blev sat til 55 + 5%

Lys fra kl. 21 til 09. Mørke fra kl. 09 til 21. Luftskifte 10 /t.

Der er konstateret afvigelser i luftfugtigheden d. 6/3, 8/3 og 15/3 1999. I alle tilfælde var der tale om en kortvarig overskridelse, og der er ikke målt luftfug-tighed på over ca. 80%.

Det vurderes, at de konstaterede afvigelser ikke har haft indflydelse på under-søgelsens resultat.

4.5 Foder/fodringsmønster

Altromin 1324, vedligeholdelsesfoder. Der tildeles foder ad libitum.

4.6 Vand

Syrnet drikkevand ad libitum (IT/DYR/GENE/024)

4.7 Holdinddeling og dosering

Dosering via foder.

Hold 1 (Dyr nr. 1-6/7-12, han/hun): Kontrol (Altromin 1324) med vehikel (acetone)

Hold 2 (Dyr nr. 13-18/19-24, han/hun) 1/5 x NOAEL: mg/kg foder:

[CH; 0.3, BR; 60, AL; 36, CB; 90 & MA; 25 ], dvs totalt 211.3 mg/kg foder.

Hold 3 (Dyr nr. 25-30/31-36, han/hun): NOAEL: mg/kg foder:

[CH ; 1.5, BR; 300, AL; 180, CB; 450 & MA; 125 ], dvs totalt 1056.5 mg/kg foder.

Hold 4 (Dyr nr. 37-42/43-48, han/hun): 5 x NOAEL: mg/kg foder: [CH ; 7.5, BR; 1500, AL; 900, CB; 2250 & MA; 625 ], d.v.s. totalt

5282.5 mg/kg foder.

(Hold 4 udgik af forsøget efter blot én dags dosering.)

Kontrol af dosering/stofforbrug: Der blev udtaget foderprøver (ca. 50 g) af test-foderblandinger (IT/DYR/FODER/016) ved doseringens start og afslutning. Prøverne blev sendt til afdelingen for kemiske forureninger ved Institut for Fødevareundersøgelser og Ernæring, VFD, og analyseret for koncentration og opblanding (homogenitet) samt holdbarhed/stabilitet ved stuetemperatur og ved køleskabstemperatur af ovennævnte pesticider i de respektive foderblandinger.

Resultaterne af analyserne viste, at koncentrationerne af pesticiderne i de tre test-foderblandinger var som planlagte på 2 nær undtagelser (Genfinding på

76 - 107%). Den ene undtagelse gælder Chlorpyrifos i hold 2, der lå under den planlagte koncentration (genfinding på 61%) og Carbendazim i hold 4, der var højere end planlagt (genfinding på 122%).

Test for homogenitet foretaget på hold 2-foder viser, at opblandingen af pesticiderne var tilfredsstillende.

Undersøgelserne for holdbarhed af teststofferne i foderblandingen viste tilfredsstillende holdbarhed for alle stoffer på nær Mancozeb, der var mindre stabilt ved stuetemperatur. Dette sidste må inkluderes ved vurderingen af eksponeringen af rotterne, da foderet blev givet til rotterne for en uge ad gangen..

4.8 Biologiske parametre

Kliniske observationer: Dyrene blev tilset 2 gange dagligt i forsøgsperioden i henhold til IT/DYR/GENE/023. Kliniske fund noteredes på tilsynsskema med angivelse af dato for observationen og dyre- og forsøgsnummer.

Udvidet klinisk observation: Første gang i forperiode og derefter ugentligt.

Adfærdstestning: Blev ikke foretaget.

Øjenundersøgelse: Blev ikke foretaget.

Legemsvægt, tilvækst, foderforbrug og vandforbrug: Dyrene blev vejet ved forsøgsstart, derefter hver syvende dag og på aflivningsdagen (IT/DYR/DATA/04). Tilvæksten blev beregnet én gang ugentligt. Tildeling af foder, tilbagevejning af restfoder og måling af vandforbrug blev foretaget en gang ugentligt på de samme dage som dyrene blev vejet.

4.9 Blodprøvetagning

Plan for blodprøvetagning:

Opsamling af blod (IT/DYR/GNA/012) til hæmatologi og klinisk kemi blev foretaget .

4.10 Urinopsamling

Indikation (øget vandforbrug eller farvet urin) ved slutningen af doseringsperiode. Undersøgelse af urin blev ikke foretaget.

4.11 Klinisk kemiske parametre

Blod og hjernehomogenat: Plasma analyseres for flg. parametre: glukose (IT/MUT/KLK/16), cholesterol (IT/MUT/KLK/20), urea (IT/MUT/KLK/21), kreatinin (IT/MUT/KLK/18), calcium (IT/MUT/KLK/17), albumin (IT/MUT/KLK/31), protein (IT/MUT/KLK/19), cholinesterase (IT/MUT/KLK/23), alanin-amino-transferase (IT/MUT/KLK/25), alkalisk fosfatase (IT/MUT/KLK/24). Hjernehomogenat fra venstre hjernehalvdel analyseres for protein (IT/MUT/KLK/19) og cholinesterase (IT/MUT/KLK/23).

Urin: Urin analyseres efter indikation ifølge IFT/MUT/KLK/11.

4.12 Hæmatologiske parametre

Følgende parametre blev bestemt: Middelcellevolumen, hæmoglobin koncentration, antal røde og hvide blodlegmer, antal thrombocyter, differentialtælling af leukocytter. Efterfølgende beregnedes hæmatocrit, "mean cell hemoglobin concentration", "mean cell hemoglobin" og "mean cell volume" (IT/PAT/APP/01 og IT/PAT/PROC/12).

Koaguleringstid: Udførtes ikke.

4.13 Morfologiske undersøgelser af urin

Undersøgelse blev ikke gennemført.

4.14 Patologiske parametre

Aflivningskriterier:
Klinisk syge dyr blev sendt til sektion, når tilstanden skønnedes at medføre døden inden for 24 timer, eller hvis dyrets tilstand var sådan, at det måtte anses for uforsvarligt eller uetisk at lade dyret leve (f.eks. længerevarende ophørt ædelyst eller store vægttab).

Nødsektion: Aflivning foretages i henhold til IT/PAT/PROC/01. Selvdøde dyr kommes i en plastikpose og bringes hurtigst muligt på køl, (kølelab. F 206), indtil obduktion kan finde sted, og patologisk sektion/vagthavende dyrlæge underrettes. Ved dødsfald eller aflivning før den planmæssige aflivning håndteres dyret i henhold til IT/PAT/PROC/03. Dyret obduceres i henhold til IT/PAT/PROC/02. Udtaget væv fikseres i 4% formaldehyd i henhold til IT/PAT/PROC/18.

Aflivnings- og sektionsprocedure :
Dyrene aflives som beskrevet i IT/PAT/PROC/01 og obduceres i henhold til IT/PAT/PROC/02, idet de nedenfor angivne væv henholdsvis vejes og fikseres.

Organer til vejning: Lever, nyrer, binyrer, testikler, epididymidis, thymus, milt, hjerne og hjerte fra alle hold trimmes og vejes (IT/PAT/PROC/09).

Følgende væv fikseres: Fra alle hold fikseres hjerne, hypofyse, oesophagus, spytkirtler (gl. mandibularis), mave, pancreas, duodenum, jejunum, ileum, caecum, colon, rectum, krøslymfeknude, lever, nyrer, binyrer, milt, hjerte, aorta, thymus, thyroidea/parathyroidea, trachea og lunger, testis, bitestis, ovarier, uterus, mælkekirtelvæv, accessoriske kønsorganer, urinblære, sternum (benmarv), rygmarv, perifer nerve (n. ischiaticus) og højre lårmuskel (højre kropshalvdel) (IT/PAT/PROC/18) samt alle makroskopiske forandringer.

Histologisk præparation:

Vævet trimmes, præpareres og snittes som anført i IT/PAT/PROC/04, 05, 06 og 07. På hjerne udføres præparation på højre halvdel. Vævssnittene farves som beskrevet i IT/PAT/PROC/19 med Meyers hæmatoxylin-eosin (HE-farvning). Hvis behandlingsrelaterede histologiske forandringer findes i hold 4

Histopatologisk vurdering:
Hold 1 og 4 undersøges og undersøgelsen udvides på indikation til hold 3 og hold 2 i nævnte rækkefølge. Histopatologiske fund/diagnoser registreres i LABCAT (IT/PAT/DATA/03).

4.15 Statistiske metoder til behandling af data

Biologiske data:
Data for legemsvægt, foder- og vandforbrug blev overført fra vejeprogrammet til SAS, hvor data blev behandlet ved anvendelse af PROC GLM standardforskrift IT/BIOL/DATA/09 & IT//10. Data korrigeredes i henhold til de notater, der blev foretaget under den ugentlige kontrol af papirudskrifterne. Tilvækst, foderforbrug, vandforbrug, relativt foder- og vandforbrug blev beregnet. Der oprettedes tabeller med enkeltdyrsdata for legemsvægt og tilvækst, med enkeltbursdata for foder- og vandforbrug og tabeller med relativ foder og vandforbrug. Data for legemsvægt, foder- og vandforbrug blev analyseret med variansanalyse efterfulgt af Dunnetts test.

Biokemiske data:
Analyseredes i SAS efter IT/MUT/DATA/03. Students t-test blev anvendt.

Hæmatologiske og patologiske data:
Data analyseredes med variansanalyse og på indikation efterfulgt af Dunnetts test. Data der ikke opfyldte kriterier for variansanalyse eller Dunnetts test analyseres ved brug af Kruskal Wallis test.

4.16 Rapportering

Der blev udfærdiget en samlet rapport med bidrag fra de ansvarlige for biokemiske og patologiske parametre (Resultater fra foderanalysen vil medfølge som bilag til rapporten).

4.17 Arkivering

Følgende opbevares på Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi i 10 år: Forsøgsplan, bilag og notater, "rådata", herunder håndskrevne og udprintede forsøgsresultater og anden dokumentation, beregnede data og statistiske behandling heraf, al modtagen og afsendt korrespondance, forsøgsrapport arkiveres i rum D 008. Fikseret væv opbevares i F 212 under forsøget og i F 007 efter, og paraffinindstøbt væv, histologiske præparater arkiveres i D 008. Foderprøve fra de 4 fodertyper opbevares 1 år i GLP-fryser rum D 008.

| Front page | | Contents | | Previous | | Next | | Top |