Mikrobiologiske bekæmpelsesmidlers effekter på invertebrater

Bilag 3

Detektion af Streptomyces griseoviridis

Baggrund

Ved undersøgelse af effekter ved brug af mikrobiologiske bekæmpelsesmidler er det nødvendigt at kunne genkende og detektere organismerne efter udsættelse. S. griseoviridis udgør den aktive mikrobielle komponent i det svampeantagoniske plantebeskyttelsesmiddel »Mycostop«. Taksonomisk placeres S. griseoviridis inden for streptomyceterne i gruppe 17 (S. griseoviridis gruppen) (Williams et al., 1983). Ud over S. griseoviridis indeholder denne gruppe fem andre arter af streptomyceter. Ifølge Williams et al. (1983) er dannelse af røde sporer karakteristiskt, men ikke unikt, for denne gruppe. Et andet karakteristika, som deles med gruppe 16, er evnen til at vokse på 0,01% (w/v) natrium acid. Herudover forefindes i de forskellige streptomycet grupper et vist, dog varierende, niveau af rifampicin resistens. Ingen af disse karakteristika er imidlertid unike, og den røde sporefarve optræder først efter 3 ugers inkubering. Ud over fænotypiske karakteristika er der også mulighed for at anvende genetiske karakteristika. Eftersom der stort set ikke foreligger genetiske data og DNA sekvenser for S. griseoviridis er det oplagt at undersøge mulighederne for at anvende en DNA karakteriserings metode som »random amplified polymorphic DNA« (RAPD) eller forsøge at anvende de generelle data som forefindes vedrørende sekvenserne af de ribosomale RNA gener. Der foreligger enkelte undersøgelser vedrørende streptomyceters ribosomale RNA sekvenser og mulighederne for at anvende disse som identifikationssystem for streptomyceter. Stackebrandt et al. (1991) anvender syntetiske oligonukleotider som hybridiseringsprober og kan ud af 62 streptomycet isolater begrænse antal mulige S. griseoviridis kandidater til tre ved hjælp af to prober. Mehling et al. (1995) anvender en PCR baseret metode i kombination med »restriction fragment length polymorphism« (RFLP) til at kunne skelne 33 streptomyceter på 16S ribosomal DNA sekvensforskelle. Endelig er der mulighed for at anvende DNA spacer sekvensen mellem generne for 16S og 23S ribosomale RNA. Dette sekvensområde varierer med hensyn til antal basepar, og det har vist sig anvendeligt ved typning og identifikation af bakterier (Jensen et al., 1993; Gürtler and Stanisich, 1996).

Metoder

Bakteriestammer. Der er blevet anvendt en række forskellige streptomyceter repræsenterende forskellige grupper, jævnfør Williams et al. (1983). Herudover er der afprøvet Bacillus subtilis som repræsentant for en anden Grampositiv bakterie. Bakterierne er angivet i Tabel 1. Da det endelige formål med at selektere for streptomyceter er at blive i stand til at genfinde udsatte S. griseoviridis i jord, er der også anvendt mikroorganismer ekstraheret fra jord i medieoptimeringsproceduren. Bakterier dyrkes ved 25°C.

Substrat baseret selektion. Indledningsvis blev det undersøgt om det var muligt at anvende den røde sporefarve som selektivt kriterie på ISP4 substratet (Shirling and Gottlieb, 1966). Derefter blev der afprøvet tre forskellige streptomycet selektive substrater i forskellige kombinationer med rifampicin, natrium azid og Delvocid (natamycin-lactose, 1:1) med henblik på at optimere det selektive pres for S. griseoviridis. De tre substrater som blev afprøvet var: Starch-casein-KNO₃ (sta-cas),Glycerol-arginin (gly-arg) og raffinose-histidin (raf-his) (Korn-Wendisch and Kutzner, 1992). I en række efterfølgende forsøg blev der optimeret for følgende parametre:

• Bakterier (jvf tabel 1) og jordmikroorganismer
• satcas og glyarg substraterne
• 25 og 50 mg/ml rifampicin
• 0.00125, 0.0025, 0.0050, 0.0075 og 0.01% natriumazid
• 50 og 100 mg/ml Delvocid

Tabel 1
Anvendte bakterier

1: S: Streptomyces, B: Bacillus
2: Ifølge Williams et al. (1983)
*: Type stamme
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorrganismen und Zellkulturen GmbH
ATCC: American Type Culture Collection

Ekstraktion af DNA til PCR. Bakterier inokuleres på fast LB substrat (Sambrook et al., 1989) og inkuberes natten over ved 25°C. Med en tandstik skrabes bakterier op fra LB substratet. Bakterierne resuspenderes i 200 ml vand i Eppendorfrør og inkuberes i kogende vandbad i 10 min. Efter afkøling på is centrifugeres 15 000×g i 10 min, og den DNA holdige supernatant overføres til nyt Eppendorfrør. Hvis der er mulighed for, at der kommer sporer med ved afskrabning af bakterier fra LB substratet, bør centrifugeringen og aftagning af supernatant gentages. DNA opløsning opbevares i køleskab

PCR med streptomycet DNA. Reaktionsblandingen for PCR indeholdt i 25 ml: 10mMTris-HCl, pH 8.3; 2 mM MgCl₂; 50 mM KCl; 0,2 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP; 0,05 mg af hver af de to primere G1 og L1 (Jensen et al., 1993), 1 ml DNA opløsning og 0,5 U Taq polymerase (BoehringerMannheim). DNA'et blev amplificeret i løbet af 25 cycler, hver bestående af 1 min ved 94°C, 1 min ved 55°C og 2 min ved 72°C. PCR produkter blev analyseret ved 1.5% agarose gel elektroforese.

Resultater og diskussion

Selektion baseret på sporefarve. Det viste sig ikke at være muligt at opnå den røde sporefarve på IPS4 substratet. Videre forsøg på at selektere på basis af sporefarve blev opgivet.

Substrat baseret selektion. I det første forsøg blev de tre selektive substrater sta-cas, gly-arg og raf-his afprøvet til dyrkning af streptomyceter. Rafhis substratet blev bortvalgt, da det resulterede i en alt for lav væksthastighed.

På basis af en lang række optimeringsforsøg blev den mest optimale mediekombination for semiselektiv dyrkning af S. griseoviridis baseret på gly-arg substratet med 50 mg/ml Delvocid og 0.005 % natrium-azid. Samtidig ser denne mediekombination meget lovende ud til isolering af streptomyceter fra jord, idet der blev observeret kolonier med streptomycet lignende morfologier, og pladerne blev ikke overvokset af svampe. En måske lidt overraskende observation var, at den aktive komponent i Mycostop, S. griseoviridis, viste markant større væksthastighed end S. griseoviridis (DSM40229).

PCR analyse af streptomycet DNA. Ved indledende forsøg med dyrkning af streptomyceter på forskellige substrater forud for DNA preparering fandt vi, at streptomycet selektive substrater var uegnede, da bakterierne sporulerede på disse. LB substratet viste sig i højere grad at stimulere vegetativ vækst og resulterede i den bedste reproducerbarhed ved PCR. På basis af rapporten om, at det var muligt at differentiere mellem streptomyceter med en række oligonukleotider med homologi til de ribosomale RNA gener (Stackebrandt et al., 1991) forsøgte vi at anvende disse oligonukleotider som primere ved PCR analyser. Det lykkedes ikke at finde en primerkombination som resulterede i et specifict produkt for S. griseoviridis. Derimod lykkedes det at finde et specifikt PCR produkt ved anvendelse af de universelle G1 og L1 primere, som bindes i henholdvis 16S rRNA og 23S rRNA genet, hvorved der opnås amplificering af spaceren mellem de to gener. Alle de analyserede streptomyceter (bortset fra Mycostop) viste et karakteristiskt 2-bånds mønster, som afhængig af streptomycet art havde varierende molekylvægt. Denne variation er dog næppe stor nok til at spacerens molekylvægt kan anvendes ved rutineidentifikation, men den variation, som findes vil efter en DNA sekvens analyse kunne anvendes til design af primere med henblik på PCR diagnostik. Mycostop, som indeholder S. griseoviridis, viste sig at resultere i et ekstra PCR bånd ud over det karakteristiske 2-bånds mønster med G1 og L1 primerne, hvilket ikke var tilfældet for S. griseoviridis typestammen DSM40229. Med basis i disse observationer er der gode muligheder for at udvikle specifikke molekylære identifikations redskaber til streptomyceter. RAPD metoden skønnes ikke at være egnet til at skelne mellem Streptomyces arter, men vil sandsynligvis være velegnet til at skelne mellem isolater inden for de enkelte arter.

Referencer

Gürtler, V. And Stanisich, V.A., 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S23S rDNA spacer region. Microbiology 142:316.

Jensen, M.A., Webster, J.A., and Straus, N., 1993. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reactionamplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Applied and Environmental Microbiology 59: 945952.

KornWendisch, F. and Kutzner, H.J., 1992. The family Streptomycetaceae. In: The Procaryotes. Second edition. Eds.: Balows, A., Trüper, H.G., Dworkin, M., Harder, W, and Schleifer, K.H. SpringerVerlag. Vol I pp. 921995.

Mehling, a., Wehmeier, U.F., and Piepersberg, W., 1995. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA: towards a specific identification system for streptomycetes using PCR. Microbiology 141: 21392147.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Shirling, E.B. and Gottlieb, D., 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology 16:313340.

Stackebrandt, E., Witt, D., Kemmerling, C., Kroppenstedt, R., Liesack, W., 1991. Designation of streptomycete 16S and 23S rRNAbased target regions for oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology 57: 14681477.

Williams, S.T., Goodfellow, M., Alderson, G., Wellington, E.M.H., Sneath, P.H.A., and Sackin, M.J., 1983. Numerical analysis of Streptomyces and related genera. Journal of general Microbiology 129: 17431813.