Mikrobiologiske bekæmpelsesmidlers effekter på invertebrater

Bilag 2

Effekten af udvalgte Bacillus thuringiensis stammer på nematoden Panagrellus redivivus i et simpelt testsystem

Baggrund

På basis af DNA sekvenser for gener (Narva et al., 1991), som koder for nematicidale proteiner, fik vi fremstillet en række primersæt med henblik på diagnosticering af nematicidale egenskaber ved hjælp af PCR. Vi fandt ved PCR screening af en samling af B. thuringiensis/B. cereus fra jord, at omkring 50% af isolaterne var positive for et af de nematicidale gener. Med basis i denne observation indarbejdede vi et bioassay med henblik på testning af B. thuringiensis effekter på den fritlevende nematod Panagrellus redivivus, som kan dyrkes sterilt på kunstigt substrat.

Metoder

Panagrellus redivivus. En steril kultur af P. redivivus blev stillet til rådighed af Jørgen Grønvold, KVL. P. redivivus tilhører en slægt, som kan findes i medier, hvor der sker fermentative forandringer under produktion af syre (Goodey, 1963). Dyrkningsmediet indeholder 4 gram Bacto-Soytone og 2,3 gram Bacto-Liver, som suspenderes i 100 ml sterilt vand. Af denne suspension overføres 10-15 ml til sterile 100 ml bluecap flasker. Der autoklaveres 7 min i Certoklave (Certoclave muliggør reducering af opholdstid ved høje temperaturer). Mediet opbevares i køleskab. Nematodkulturen opretholdes ved overførsel hver 2.-6. uge af ca. 1 ml gammel kultur til nyt medie, og der inkuberes mørkt ved stuetemperatur. Langtidsopbevaring af nematodkultur kan ske ved 4-15°C. Nematoderne klargøres til bioassay ved en række trin, hvor der anvendes sterile glasvarer, filtre og PBS (per liter: 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄,0.24 g KH₂PO₄, pH 7.0, autoklaveres 20 min.).

Ved hjælp af henstand/dekantering og filtreringer er det muligt at opnå en stort set homogen population af voksne nematoder: En ca. to uger gammel kultur fortyndes 5 gange med PBS, omrystes og henstår 5 min indtil de største nematoder er søgt til bunden, hvorefter så meget som muligt af væsken hældes bort. Denne fortyndinghenstanddekantering gentages yderligere mindst to gange. Et filter med netstørrelse på 0.04 mm anbringes i bægerglas, og nematodkulturen hældes i filtret, hvorved små nematoder og æg passerer filtret, mens store nematoder tilbageholdes. De tilbageholdte nematoder skylles 23 gange med PBS i filteret. Med pipette overføres nematoderne til et 0,2 mm filter i et bægerglas. Levende nematoder søger gennem filteret, mens døde nematoder forbliver inde i filtret. Filtreringen gentages. Nematoddensiteten bestemmes ved hjælp af stereolup. Der tilstræbes en densitet på 10 nematoder pr 50 ml PBS.

B. thuringiensis krystalspore preparation. Bakterierne, som er angivet i Tabel 1, blev udpladet på T3 plader (Travers et al., 1987), inkuberet ved 30°C i 34 døgn indtil sporulering og krystalproduktion. Med steril podenål afskrabes bakterier, som overføres og resuspenderes i Eppendorf rør med 1 ml PBS med 1 mM dithiothreitol (DTT). Bakterier centrifugeres ned, supernatant fjernes og pellet resuspenderes i PBS med 1 mM DTT. Bakteriesuspensionernes densitet bestemmes ved tælling i et BürkerTürk tællekammer (dybde 0,01 mm), hvorefter bakteriedensiteten indstilles til 10⁹/ml i alle preparationerne.

Bioassay. Den oprensede nematodfraktion tilsættes teracyclin og chloramphenicol, begge til en koncentration på 45 mg/ml. Under konstant omrystning udtages 50 ml oprensede nematoder, som overføres til brøndene i 96huls mikrotiter plader. For hver bakterie anvendes tre brønde. Antal levende/døde nematoder optælles før tilsætning af bakterier. Til hver brønd blev tilsat 25 ml bakteriesuspension, hvorved der opnås en densitet på 3,3×10⁸/ml, og antibiotika koncentrationen er nu 30 mg/ml. Som kontrol tilsættes 25 ml PBS med 1 mM DTT til 3×3 brønde med nematoder. Antal levende/døde nematoder blev optalt efter 24, 48, 72, 96 og 168 timer.

Resultater og diskussion

Klargøring af nematoder. Ved et kvantitativt assay med dyrkede nematoder er der umiddelbart to praktiske problemer. For det første er det nødvendigt, at kun relativt få nematoder inkuberes i hver brønd, eftersom deres bevægelsesaktivitet vanskeliggør optælling. For det andet er det nødvendigt at fraktionere nematodpopulationen. I de indledende forsøg, hvor vi anvendte ufraktioneret kultur, viste det sig, at vi med tiden så flere og flere levende nematoder. Dette skyldes, at nematoder, som var meget små, ikke blev talt med ved forsøgsstart, men først senere efter vækst. Dette forhold nødvendiggjorde, at forsøgene gennemførtes med store nematoder.

Vi valgte at anvende de voksne nematoder, dels fordi de er størst, men også fordi de bevæger sig relativt langsommere end larvestadierne. Ved den beskrevne fraktioneringsprocedure opnåede vi ved gentagen fortynding og dekantering, at æg og hovedparten af de døde nematoder blev fjernet. Ved filtrering gennem et 0,02 mm filter blev stort set alle små nematodstadier fjernet, og ved den afsluttende filtrering gennem et 0,2 mm filter blev næsten alle de resterende døde nematoder fjernet.

Tabel 1
Bacillus isolater anvendt ved nematod bioassay

1. Patentbeskyttede stammer med aktivitet over for nematoder (Edwards et al., 1990; Narva et al., 1991)
2. Bt/Bc morfologi: Der er ikke analyseret for d-endotoxin produktion, hvorfor der ikke kan skelnes mellem B. thuringiensis og B. cereus
3. PCR analyser viser samme nematicidale gen som den patenterede B. thuringiensis no 114.

Effekt på P. redivivus. Ved indledende forsøg uden anvendelse af antibiotika eller med 15 mg/ml tetracyclin og chloramphenicol fandt vi, at alle B. thuringiensis isolaterne var letale over for P. redivivus. I begge situationer var det tydeligt at der skete mikrobiel vækst. Med 30 mg/ml af de to antibiotika blev der ikke observeret synlig bakterievækst i syv døgn, og effekten på nematoderne var nu afhængig af B. thuringiensis isolatet, sandsynligvis mere præcist den producerede protein krystal. Dette forhold tyder på, at alle vegetativt voksende B. thuringiensis isolater er toksiske overfor P. redivivus, og at krystal toksinerne på den anden side ikke virker generelt. Effekten af de 47 B. thuringiensis isolater på P. redivivus fremgår af diagrammerne i Fig 1, A-F, hvor de fyldte søjler repræsenterer levende nematoder, mens de døde er repræsenteret ved tomme søjler. I Fig 2 AJ er vist udvalgte bakteriers effekt på P. redivivus som funktion af tiden.

De tre første B. thuringiensis isolater i Fig 1 repræsenterer de tre mest kommercielt anvendte B. thuringiensis med aktivitet over for henholdsvis sommerfugle (nr. 3), biller (nr. 34) og myg (nr. 36). De to næste (38, 39) er danske bladisolater med ukendt aktivitet. De tretten næste (113-125) er patenterede B. thuringiensis isolater med nematicidal aktivitet. De følgende 23 isolater (193-243) er isoleret fra jord udelukkende på basis af kolonimorfologi. Seksten ef disse isolater er ved hjælp af PCR fundet at indeholde det samme nematicidale gen som den patenterede B. thuringiensis nr 114 (resultat er ikke vist). De sidste seks isolater (312-346), som ikke har kendte aktiviteter, er fundet på kålblade.

Allerede efter 24 timer (Fig 1B og Fig 2F) er det klart, at isolat 118 har høj letal aktivitet over for P. redivivus, men også isolaterne 113 (Fig 2E), 120 og 124 har resulteret i stor andel af døde nematoder. Efter 72 timer ses i Fig 1D, at ud over 113, 118, 120 og 124 har også 116, 121, 122, 123, og 125 aktivitet over for P. redivivus. De nematicidale isolater 114, 115, 117 og 119 (Fig 2G) virker ikke toksisk over for P. redivivus. Det samme gør sig gældende for de øvrige isolater i undersøgelsen. Det skal bemærkes, at det patenterede isolat 114 ikke har effekt på P. redivivus, hvilket også er tilfældet for jordisolaterne, som indeholder samme gen som isolat 114. Aflæsningerne efter 96 og 168 timer bærer præg af begyndende uspecificitet, hvilket sandsynligvis skyldes uspecifikke dødsfald grundet alderdom, for stor tæthed af nematoder samt begyndende inaktivering af antibiotika, med sporespiring og vegetativ B. thuringiensis vækst som følge. Dette er illustreret i Fig 2I med isolat 222 og i Fig 2J som er en kontrol uden bakterier. Begge inkubationer indeholdt 29 nematoder, og i begge tilfælde ses begyndende dødsfald blandt nematoderne i slutningen af undersøgelsesperioden, men denne tendens er stærkere når nematoderne har været inkuberet sammen med bakteriesporer. I Fig 1F ses, at i de to kontrolinkubationer (c2 og c3), hver med kun 4 nematoder, har alle nematoder overlevet.

Resumé

Med henblik på hurtigt at kunne afgøre om et givet Bacillus thuringiensis isolat er toksisk over for nematoden Panagrellus redivivus har vi indarbejdet et simpelt in vitro bioassay. For at simplificere optælling af levende og døde nematoder foretages en fraktionering af nematodkulturen, som anvendes. Ved hjælp af dekanteringer og filtreringer er det muligt at opnå en fraktion, som næsten udelukkende indeholder de største nematoder, mens diverse larvestadier, æg og døde nematoder er fjernet.

Alle 47 undersøgte B. thuringiensis isolater er i den vegetative vækstform toksiske over for den fritlevende nematod Panagrellus redivivus. Hvis vegetativ bakterievækst forhindres med antibiotika, udviser kun et mindre antal af de undersøgte isolater toksiske effekter over for nematoden. Ingen af de kommercielt anvendte isolater på sporekrystalform viste aktivitet over for P. redivivus, hvilket også var tilfældet med de danske jord og blad isolater.

Referencer

Edwards, D.L., Payne, J., and Soares, GG., 1990. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes. United States Patent no 4948734. 5 pp.

Goodey, T., 1963. Soil and Freshwater Nematodes. Methuen & Co, London. 544 pp.

Narva, K.E., Payne, J.M., Schwab, G.E., Hichle, L.A., Galasan, T., and Sick, A.J., 1991. Novel Bacillus thuringiensis microbes active against nematodes, and genes encoding novel nematodeactive toxins cloned from Bacillus thuringiensis isolates. European Patent Application number 91305047.2, 47 pp.

Travers, R.S., Martin, P.A.W., and Reichelderfer, C.F., 1987. Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp. Applied and Environmental Microbiology 53: 12631266.