Økotoksikologisk vurdering af begroningshindrende biocider og biocidfrie bundmalinger

Bilag 2. Undersøgelse af mineraliseringen af DCOI og zinkpyrithion i marine sedimenter

1. Indledning

Mineraliseringen af 4,5-dichlor-2-n-octyl-4-isothiazolin-3-on (DCOI) og zinkpyrithion blev undersøgt i laboratorieforsøg med kystnære, marine sedimenter. Forsøgene blev udført under aerobe og anaerobe forhold ved anvendelse af testkoncentrationer i ng/g, der antages at give en miljørealistisk omdannelseskinetik. I de anaerobe eksperimenter blev sulfatreducerende forhold etableret ved tilsætning af sulfat. Kystnære, marine sedimenter indeholder betydelige mængder af sulfat (Sørensen et al. 1979). Glukose blev medtaget i forsøgene for at undersøge mineraliseringen af et let bionedbrydeligt stof i lav koncentration og under de givne eksperimentelle betingelser.

2. Materialer og metoder

Sediment og havvand

Sedimentprøver og tilhørende havvand blev indsamlet fra to lokaliteter i Øresund. De to sæt af sediment og vandprøver kan beskrives som angivet nedenfor.

Lerholdigt sediment (LS)

• Lokalitet: Øresund, 55° 50'642N - 12° 40'854E; dybde (sediment), 22 m; dybde (vand), 20 m.
• Tekstur: grovsand (0,25-2 mm), 0,9%; finsand (0,063-0,25 mm), 26,4%; silt og ler (<0,063 mm), 65,8%; organisk stof, 6,9%.
• Antal bakterier (vand): 3,1 × 10³ pr. mL.
• Antal bakterier (sediment): 1,5 × 10⁵ pr. g.

Sandet sediment (SS)

• Lokalitet: Øresund, 55° 50'030N - 12° 37'534E; dybde (sediment), 4 m; dybde (vand), 2 m.
• Tekstur: grovsand, 91,5%; finsand, 7,3%; silt og ler, 1,0%; organisk stof, 0,2%.
• Antal bakterier (vand): 2,1 × 10³ pr. mL.
• Antal bakterier (sediment): 4,8 × 10⁴ pr. g.

Antallet af bakterier i havvand og sediment blev bestemt som kimtal ved indstøbning af en kendt mængde af prøven i Bacto Marine Agar 2216 (Difco). Sediment (ca. 1,6 g) blandes med 9 mL fosfatbuffer og behandles herefter som en vandprøve. Kimtallet bestemmes som antallet af kolonier, der er vokset frem efter 72 timers inkubering ved 21° C. Sediment og vandprøver blev opbevaret adskilt i mørke ved 4° C indtil anvendelsen.

Kemikalier

[2,3-¹⁴C]DCOI (Lot Nos. 853.0208 og 853.0209; 15,9 mCi/mmol, 56,44 µCi/mg, radiokemisk renhed 98,6%) blev leveret af Rohm and Haas Research Laboratories (Spring House, Pennsylvania). [¹⁴C]zinkpyrithion (Lot. No. 3228-143; 157,63 mCi/mmol, 0,50 mCi/mg) og [UL-¹⁴C]D-glukose (Lot 48H9476 Sigma; 212,5 mCi/mmol, 1,18 mCi/mg, opløst i ethanol:vand, 9:1) blev leveret af Arch Chemicals (Cheshire, Connetticut). Alle øvrige kemikalier var kommercielt tilgængelige og af analytisk renhed.

Aerobe bionedbrydnings-forsøg

De aerobe bionedbrydningsforsøg blev udført med både sediment LS og SS. Stamopløsninger af [¹⁴C]DCOI (i methanol), [¹⁴C]zink-pyrithion (i dimethyl sulfoxid) og [¹⁴C]glukose (i deioniseret vand) blev tilsat til 300-mL glasflasker med 10 g sediment (vådvægt) og 50 mL havvand, der forinden var blevet beluftet med atmosfærisk luft i ca. 20 timer. For [¹⁴C]DCOI blev stamopløsningen tilsat til forsøgsflasker med 0,5 g tørret sediment, og methanolen blev tilladt at fordampe, inden yderligere sediment og vand blev tilført. De øvrige stoffer blev tilsat ved at blande stamopløsningen med sedimentet, hvorefter der blev tilsat havvand. De resulterede koncentrationer af de tre modelstoffer er angivet i tabel B.1. To glasrør blev anbragt i forsøgsflaskerne, et med 1N KOH (3 mL) for absorption af ¹⁴CO₂ og et med ethylenglykol for opsamling af andre gasformige forbindelser. Flaskerne blev lukket med gummipropper og aluminiumskruelåg og blev stillet mørkt ved 15° C.

Mineralisering af stofferne blev fulgt ved at bestemme ¹⁴C-aktiviteten, der var opsamlet i glasrørrene. Hver uge blev udtaget prøver til væske-scintillationstælling, og forsøgsflaskerne blev stillet mørkt uden låg i ca. 10 min. for udskiftning af flaskernes gasfase med atmosfærisk luft. Herefter blev indholdet i glasrørrene erstattet med frisk KOH eller ethylenglykol. Ved afslutningen af forsøget efter 42 dage blev CO₂ i vandfasen frigjort efter forsuring af sediment-vand-systemet til pH 1-2 ved tilsætning af koncentreret svovlsyre.

Anaerobe bionedbrydningsforsøg

De anaerobe bionedbrydningsforsøg blev kun udført med sediment LS. På samme måde som i de aerobe forsøg blev stamopløsninger af de tre modelstoffer tilsat til 117-mL serumflasker med 30 g sediment (vådvægt) og 30 mL havvand. De resulterede koncentrationer af de tre modelstoffer er angivet i tabel B.2.1. Inden anvendelsen var havvandet blevet forbehandlet ved tilsætning af en fosfatbuffer (27 mg KH₂PO₄ og 112 mg Na₂HPO₄ × 12H₂O pr. liter) for stabilisering af pH og en redox-indikator (1,0 mg resazurin pr. liter) for at kunne kontrollere, at anaerobe betingelser var til stede gennem forsøget. De enkelte serumflasker blev tilsat sulfid
(0,5 g Na₂S× 9H₂O/kg) som reducerende middel, mens sulfat (Na₂SO₄; 25 mM i vandfasen) blev tilsat som elektronacceptor for etablering af sulfatreducerende forhold, der er karakteriske for marine sedimenter. Et glasrør med 1N KOH (3 mL) blev anbragt i serumflaskerne for absorption af ¹⁴CO₂. Under hele den ovennævnte procedure blev serumflaskerne omhyggeligt beluftet med iltfri N₂-gas, indtil de blev lukket med 1-cm butylgummipropper og aluminiumlåg. Forsøgsflaskerne blev stillet mørkt ved 15° C.

Mineralisering af stofferne blev fulgt ved at bestemme ¹⁴C-aktiviteten (fra ¹⁴CO₂), der var opsamlet i glasrøret med KOH. Udtagning af KOH til væskescintillationstælling blev foretaget efter 14, 28 og 56 dage, hvorefter væsken i glasrøret blev erstattet af frisk KOH. Da en del af kulstoffet ved mineralisering af modelstofferne kan omdannes til methan, blev ¹⁴CH₄ bestemt ved at indsprøjte 2-mL gasprøver i scintillationsglas, der var modificerede, så lågene kunne holde et septum (Zehnder et al. 1979). Inden anvendelsen blev der boret et hul i skruelåget til hvert scintillationsglas og indsat et butylgummi-septum. Scintillationsglassene blev fyldt med 20 mL af en væskescintillations-cocktail (Insta gel II plus, Packard), der viste sig at kunne absorbere ca. 2/3 af den tilsatte methan i pilotforsøg. Ved afslutningen af forsøget efter 56 dage blev CO₂ i vandfasen frigjort efter forsuring af sediment-vand-systemet til pH 1-2 ved tilsætning af koncentreret svovlsyre.

Tabel B2.1

Genfindelse af resterende ¹⁴C

Efter afslutningen af de aerobe og de anaerobe forsøg blev den resterende ¹⁴C i vand og sediment bestemt ved følgende procedurer. I forsøget, hvor [¹⁴C]DCOI blev tilsat i koncentrationen 0,033 µg/g, og i forsøgene med [¹⁴C]glukose blev den resterende radioaktivitet bestemt efter væskescintillationstælling af delprøve fra vandfasen og afbrænding af 0,1-g sedimentprøver ved overskud af ilt. I de øvrige forsøg blev den resterende ¹⁴C i sedimentet bestemt ved ekstraktioner med 6N HCl efterfulgt af 1N NaOH, hvorefter det ekstraherede sediment blev afbrændt under overskud af ilt (Madsen & Kristensen 1997; Madsen 1999). Denne metode giver mulighed for at bestemme de fraktioner af ¹⁴C, der er bundet i form af hydrolyserbare forbindelser, humus- og fulvussyrer eller til humin/lermineraler

Kemiske analyser

DCOI og nedbrydningsprodukter fra omdannelsen af DCOI blev analyseret og karakteriseret af Rohm and Haas (Andrew Jacobson, Rohm and Haas Research Laboratories, Spring House, Pennsylvania). Vandprøver blev behandlet med fast-fase-ekstraktion (SPE) ved anvendelse af acetat:methanol (1:1) før analyse på HPLC. Sedimentprøver blev ekstraheret to gange med acetonitril: 0,01 N HCl (4:1) efterfulgt af ekstraktion med dichlormethan for analyse på HPLC.

Zinkpyrithion og dets nedbrydningsprodukter blev bestemt af Arch Chemicals (James C. Ritter, Department of Ecotoxicology, Cheshire, Connetticut). Sedimentprøver blev ekstraheret med acetonitril efterfulgt af to ekstraktioner med 1,0 N KOH. Herefter blev vandprøver og ekstrakter fra sediment derivatiseret før analyse på HPLC (Arch Chemicals 1999b).

Den kumulerede udvikling af ¹⁴CO₂ fra mineraliseringen af DCOI og zinkpyrithion er vist i figurerne 3.1-3.3 (afsnit 3.2) og 4.1-4.3 (afsnit 4.3). Den totale mineralisering og fordelingen af den resterende radioaktivitet ved forsøgenes afslutning er vist i tabel B2.2-B2.4. Mængden af ¹⁴C i absorbere med ethylenglykol (aerobe forsøg) udgjorde <0,1% af den tilsatte radioaktivitet.

Tabel B2.2 Se her

Mineralization of DCOI in sediment and sea water under aerobic or anaerobic conditions. Distribution and retrieval of ¹⁴C after an incubation of 42 days (aerobic test) or 56 days (anaerobic test).