3. Metoder, Miljøstyrelsen

Karakterisering af havnesediment ved hjælp af biotest

Det fremgår af tabel 3.2, at alle sedimenter består af store fraktioner af meget finkornet materiale, idet 58-98% er af en kornstørrelse <0,063 mm. Sedimenterne fra henholdsvis Kattegat og Ven var de mest finkornede sedimenter, mens havnesedimenterne var mere grovkornede.

3.2 Sedimentekstrakter

Med henblik på at simulere en klapningssituation blev sedimentprøverne ekstraheret med havvand i henhold til US-EPA’s procedure for undersøgelse af forurenede sedimenter inden klapning (US-EPA 1991). Sediment og havvand (30-32‰) blev blandet i forholdet 1:4 (vol/vol) ved stuetemperatur. Dette svarer til et forhold på 115-140 g sediment (vådvægt beregnet ud fra tørstofindhold) til 400 mL havvand. Blandingerne blev omrystet kraftigt og derefter placeret på magnetomrører med kraftig omrøring i 30 min. Herefter blev blandingerne centrifugeret ved 1200 rpm i 30 min. Alle supernatanter fra hvert sediment blev poolet til en samleprøve. I alt blev der produceret 4 L ekstrakt fra hver sedimentprøve. Ekstrakterne blev opbevaret nedfrosset indtil test. Kortvarig nedfrysning har normalt ikke indflydelse på miljøprøvers toksicitet (Carr & Chapman 1995). Ekstrakter til kemisk analyse blev forbehandlet og eventuelt konserveret umiddelbart efter produktion.

Det vurderes, at der ved den her anvendte metode, hvor der foretages en kraftig omrøring gennem 30 min, vil blive frigivet større mængder af kemiske stoffer til ekstraktet, end der vil ske i praksis ved en klapning af sedimentmateriale, hvor opblandingen som regel vil være af kortere varighed. Miljøvurderingerne baseret på undersøgelser af ekstrakterne vil således være konservative.

3.3 Kemisk karakterisering

3.3.1 Kemiske analyser

Indhold af udvalgte organiske miljøfremmede stoffer samt metaller blev målt i sediment og ekstrakt af sediment efter de metoder, som er angivet i bilag A. I 1999 blev der udtaget sedimentprøver fra de samme stationer i Københavns havn og Odense havn som i denne undersøgelse, og der er derfor foretaget en sammenligning af de målte koncentrationer ved de 2 prøvetagninger og analyser.

Der blev desuden udtaget sedimentprøver og vandprøver fra test med slangestjerne til analyse for indhold af ammoniak og sulfid med henblik på en vurdering af disse stoffers eventuelle bidrag til en toksisk effekt. Resultaterne heraf et gengivet i tabel 4.3.

3.3.2 Vurdering af forureningsgrad

Sedimenternes forureningsgrad vurderes ud fra indholdet af kemiske stoffer, som bestemmes ved de kemiske analyser. En sådan vurdering svarer til trin 2 i US-EPAs strategi for vurdering af klapmateriale (US-EPA 1991), som anbefaler, at de målte koncentrationer bedømmes i forhold til gældende sedimentkvalitetskrav. Da der analyseres for en lang række stoffer, som hver især må formodes at kunne bidrage til en eventuel toksisk effekt, foretages en opsummering af bidragene fra de enkelte stoffer, idet disse bidrag regnes for additive.

Miljørisikoen af hvert enkelt stof beregnes som forholdet mellem den målte stofkoncentration (C_i) og det gældende sedimentkvalitetskrav (SKK_i) og betegnes RQ_i (Risk Quotient). Den samlede miljørisiko af flere stoffer (RQ) beregnes ved at summere de enkelte stoffers bidrag:

Hvis RQ er større en 1, vurderes der normalt at være en risiko for økotoksiske effekter på økosystemet eller de mest følsomme arter i økosystemet ved langvarig eksponering. Det kan ikke umiddelbart vurderes, hvor stor denne risiko vil være, da den samvirkende toksicitet normalt er mindre end additiv, det vil sige mindre end summen af de enkelte stoffers toksicitet. Ligeledes vil der normalt ikke kunne registreres økotoksiske effekter i test af overlevelse, før RQ bliver større end 100-1000. Dette kan udledes af, at der normalt anvendes en applikationsfaktor på 1000 til fastsættelse af kvalitetsstandarder ud fra et begrænset antal korttidstest, jævnfør blandt andet Europa-Kommissionens vejledning i risikovurdering (EC 1996).

Ved vurderingerne tages der udgangspunkt i eksisterende sedimentkvalitetskrav, som kan være fastsat i forbindelse med for eksempel EUs risikovurderingsarbejde, i Holland (RIVM 1999) eller i Canada (CCME 1999). Ligeledes anvendes forslag til sedimentkvalitetskrav for antifouling-biocider (Madsen et al. 1998). Der foretages således ikke en fastsættelse af kvalitetskrav for målte stoffer, hvor der ikke kan findes gældende kvalitetskrav, og disse stoffer udelades derfor af vurderingen.

For de målte koncentrationer i ekstrakterne foretages tilsvarende vurderinger, idet stofkoncentrationerne her vurderes imod gældende vandkvalitetskrav, jævnfør Miljø- og Energiministeriet (1996), EU risikovurderingsrapporter, RIVM (1999), CCME (1999), Petersen & Pedersen (1998), Pedersen & Samsøe-Petersen (1995) og Møller et al. (2000).

3.3.3 Vurdering af frigivelse i klapningssituation

Med henblik på at vurdere frigivelse af forurenende stoffer i en klapningssituation er der foretaget en udrystning af sediment i havvand efter US-EPAs metode (US-EPA 1991), og koncentrationer af forurenende stoffer er analyseret i ekstraktet. Da udrystningen er relativt kortvarig (0,5 time), vil der kun for de færreste stoffer være opnået en ligevægt mellem mængderne i henholdsvis sedimentprøven og ekstraktet. Fordelingskoefficienten defineret som forholdet mellem startkoncentrationen i sedimentprøven og ekstraktet betegnes Kd’ (som ikke må forvekles med ligevægtsfordelingskoefficienten Kd). Kd’ betegner således frigivelsesgraden fra det forurenede sediment under klapningssituationen:

Kd’ beregnes for sammenhørende par af målte koncentrationer i henholdsvis sediment og ekstrakt for de 4 sedimentprøver (3 havnesedimenter og kontrolsediment fra Kattegat).

3.4 Testmetoder, sediment

3.4.1 Slikkrebs (Corophium volutator)

Testen blev gennemført efter PARCOMs metodeforskrift (PARCOM 1995). Standarden foreskriver en testperiode på 10 døgn, men da DHIs erfaringer med testen viser, at en testperiode på mere end 7 døgn resulterer i en væsentlig forhøjet dødelighed i kontrollen, er eksponeringstiden reduceret.

Slikkrebs (Corophium volutator) blev indsamlet d. 26. september 2000 ud for Seabay, Orkney Mainland af personale fra Orkney Water Technology Centre Ltd. i Skotland. Efter akklimatisering blev dyrene overført til dobbeltbundede plastikposer med rent havvand, placeret i kølebokse med fryseelementer og fløjet til København, hvor de blev bragt direkte til DHI med kurér. Her blev de modtaget d. 4. oktober 2000 kl. 16. Ved ankomsten var forholdene i vandet: 70% iltmætning, 15,9°C, 21‰ salinitet, pH = 7,1.

På DHI blev dyrene akklimatiseret i et 20 L akvarium og fodret med kommercielt fiskefoder indtil 24 timer før teststart. Dyrene blev ikke fodret under testen.

Testen blev udført i 600 mL glas, som indeholdt 80 g (tørvægt) sediment og 500 mL havvand. Sedimentprøverne var forbehandlet ved tumbling i 24 t i forholdet 1 del sediment og 3 dele vand. Havvandet var indsamlet i Kattegat sydøst for Anholt af DMU. Inden teststart var havvandet filtreret gennem 10 µm, 5 µm, 0,5 µm og 0,22 µm filtre og justeret til 20‰ saltholdighed. Testen blev udført som en 7 døgns statisk test i et klimarum ved 15 ± 2°C og ved en lys:mørke cyklus på 16:8 t.

Hvert sediment blev testet i 5 replikater tilsat 10 slikkrebs af en størrelse på 5-8 mm. Dyrenes aktivitet blev registreret dagligt gennem testperioden, og ved testafslutning efter 7 døgn blev antallet af døde og levende dyr registreret i hver replikat.

3.4.2 Musling (Macoma baltica)

Muslinger (Macoma baltica) i størrelsen 0,5-1 cm blev indsamlet d. 2. november 2000 i Nivå bugt på ca. ½ m vand og bragt direkte til DHI, hvor de blev akklimatiseret i 20 L akvarier med 20‰ havvand og ca. 2 cm rent sediment indtil teststart.

I testen blev målt sedimentets effekt på adfærd (bevægelse, nedgravning) og overlevelse gennem testperioden på 6 døgn. Testen blev udført i plastikbakker, hvor den ene halvdel var fyldt med sedimentprøven og den anden halvdel med referencesediment fra indsamlingslokaliteten (jf. metode i Møhlenberg & Kiørboe 1983). Ligeledes blev der udført test, hvor der kun var tilsat sedimentprøve, samt test udelukkende med referencesediment. I bakkerne med 2 forskellige sedimenter blev testorganismerne i halvdelen af bakkerne tilsat i den del med den forurenede sedimentprøve og i den anden halvdel i den del med referencesedimentet. Testorganismernes præference for henholdsvis det forurenede sediment og referencesedimentet blev observeret gennem testperiode, ligesom andre adfærdsmæssige effekter blev registreret. Gennem testperioden blev overlevelse af testorganismerne endvidere registreret.

Testsedimentet blev blandet grundigt ved manuel omrøring og en delprøve udtaget til testen. Hver testbakke af en størrelse på ca. 15 · 22 cm og en højde på ca. 12 cm blev delt i 2 med en løs skillevæg. Testsedimentet blev fyldt i den ene halvdel af bakken i et lag på ca. 4 cm, og en tilsvarende mængde referencesediment blev fyldt i den anden halvdel af bakken. Tilsvarende blev der lavet bakker udelukkende med testsediment og andre udelukkende med referencesediment. Bakkerne blev banket let, så sedimentoverfladen jævnes ud. Herefter blev der forsigtigt tilsat ca. 2 L 20‰ havvand til hver bakke samt beluftning.

Testen med referencesedimentet blev udført i 6 replikater a 10 dyr, test med både testsediment og referencesediment i 4 replikater og test med testsedimenter i 4 replikater. I testene med 2 forskellige sedimenter (testsediment og referencesediment) blev testorganismerne tilsat halvdelen med referencesedimentet i 2 af replikaterne og halvdelen med testsedimentet i de øvrige 2 replikater.

Før teststart blev skillevæggen trukket forsigtigt op, således at testorganismerne efter tilsætning kan bevæge sig frit i testkarret. Der blev tilsat 10 testorganismer til hvert testkar og dyrenes adfærd blev iagttaget gennem den første halve time. Herefter blev testen tilset efter henholdsvis 3 timer, 1, 2, 3 og 6 døgn, hvorefter testen blev afsluttet. Gennem testperioden blev adfærd samt dødelighed registreret. Ligeledes blev der målt iltindhold, pH, temperatur og salinitet i vandfasen gennem testperioden.

3.4.3 Slangestjerne (Ophiura albida)

Slangestjerner (Ophiura albida) blev indsamlet syd for Ven i Øresund på positionen 55°58,00N og 12°42,00Ø på en vanddybde på ca. 20 m. Efter modtagelse på DHI blev dyrene akklimatiseret i havvand indtil teststart.

Testen med slangestjerner blev gennemført som testen med muslinger, idet der dog blev anvendt testkar af en størrelse på ca. 22 · 30 cm, hvori testsediment blev fyldt i et lag på ca. 2 cm. Der blev tilsat ca. 5 L 31‰ havvand. Alle sedimenter blev testet i 6 replikater a 10 dyr, og resultater blev aflæst efter 2,5 timer, 1, 2, 3, 5 og 6 døgn.

Til kontrol af indhold af ammoniak og sulfid blev der udtaget prøver af sediment og vand efter 6 døgns eksponering.

3.5 Testmetoder, ekstrakt

3.5.1 Microtox (Vibrio fischeri)

Ekstrakter af sedimentprøver blev testet i henhold til VKI’s standardforskrift for Microtox-test. Testen er baseret på måling af lysudsendelsen fra den luminiscerende marine bakterie Vibrio fischeri. I testen eksponeres bakterierne for en fortyndingsrække af ekstrakterne, og bakteriernes lysemission bestemmes efter 5, 15 og 30 minutters inkubering. En eventuel toksisk virkning af ekstraktet ses som en hæmning af lysemissionen, og den procentvise hæmning bestemmes i forhold til en kontrol, der ikke indeholder prøve.

Da ekstrakterne af sedimentprøverne blev fremstillet i havvand, blev der foretaget en test af havvand, som udgjorde en kontrolprøve. Alle ekstrakter blev testet i koncentrationerne 2,6; 5,2; 10,4; 20,8; 41,7; 83,3; 167 og 333 mL/L.

3.5.2 Planktonalge (Skeletonema costatum)

Toksiciteten af ekstrakterne blev undersøgt i en 72 timers væksthæmningstest med den marine kiselalge Skeletonema costatum (NIVA BAC 1), som holdes i kultur på DHI - Institut for Vand og Miljø (tidligere VKI). Væksthæmningstesten strækker sig over flere generationer af alger og kan derfor anses for en korttids kronisk test. Ved undersøgelsen registreres biomassen dagligt (målt ved fluorescens) i kulturer af alger, der vokser i fortyndingsrækker af ekstraktet. Væksttesten blev udført ved 28‰ salinitet, pH 8,1 og ved 19° C i overensstemmelse med ISO-metoden (ISO 10253:1995). Ekstrakterne blev testet i følgende koncentrationer: 5; 10; 20; 50; 100; 200 og 500 mL/L, dog blev ekstraktet fra sediment fra Horsens havn testet i koncentrationerne 1; 2; 5; 10; 20; 50 og 100 mL/L.

Algernes vækstrate blev beregnet på grundlag af registreringer af biomasse i løbet af testperioden, og filtratets påvirkning af vækstraten blev udtrykt som funktion af filtratets koncentration. Endvidere blev de koncentrationer, der hæmmede vækstraten henholdsvis 10% og 50% (EC10 og EC50) beregnet. Beregningerne blev udført ved hjælp af statistikprogrammet TOXEDO (VKI 1992a). Den højeste testkoncentration uden signifikant effekt (No Observed Effect Concentration, NOEC) samt den laveste testkoncentration med signifikant effekt (Lowest Observed Effect Concentration, LOEC) blev beregnet ved hjælp af Dunnett's procedure (US-EPA 1989).

Som kontrol af algernes følsomhed foretages tillige test af toksiciteten af referencestoffet 3,5-dichlorphenol hver tredje måned på DHI - Institut for Vand og Miljø.

3.5.3 Krebsdyr (Acartia tonsa)

Ekstrakternes akutte effekt blev undersøgt over for den marine planktoniske vandloppe Acartia tonsa. A. tonsa holdes i kultur på DHI - Institut for Vand og Miljø (tidligere VKI), og dyr fra denne kultur anvendes i testen. Kulturen stammer oprindeligt fra dyr isoleret fra Nordsøen af personale hos Danmarks Fiskeriundersøgelser.

Akuttesten blev gennemført under de samme betingelser som ved kultiveringen, 31‰ salinitet, pH 8,1, temperatur 20°C, 16 timer lys og 8 timer mørke.

Akuttesten blev udført som en statisk test, og som testdyr anvendtes store copepoditter og voksne dyr i overensstemmelse med standarden (ISO/IEC 14669:1999). Som fortyndingsvand anvendtes naturligt havvand indsamlet sydøst for Anholt (SNs bundfaunastation) af personale på Miljøstyrelsens skib "Gunnar Thorson".

Ekstrakterne blev testet i følgende koncentrationer: 5; 10; 20; 50; 100; 200 og 500 mL/L. Testen blev udført i 50 ml bægerglas (Pyrex) med 25 ml testopløsning. Der blev anvendt ca. 20 dyr ved hver testkoncentration (4 replika à 5-6 dyr) og ca. 30 dyr som kontrol (6 replika à 4-5 dyr). Iltindholdet og pH blev målt ved start og afslutning af testen.

Testglassene blev tilset efter 24 timer og igen efter 48 timer, og antallet af døde dyr registreret.

Resultaterne fra akuttesten behandles statistisk ved Probit Analyse ved anvendelse af EDB-programmet PROBIT (SNV 1992).

De koncentrationer, der forårsager henholdsvis 10% og 50% dødelighed (LC10-48t og LC50-48t) er beregnet. Den højeste testede koncentration uden observeret effekt NOEC (No Observed Effect Concentration) vurderes.

Som kontrol af forsøgsorganismernes følsomhed blev der tillige foretaget en test af toksiciteten af referencestoffet 3,5-dichlorphenol.