| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Afgivelse af organisk stof fra polymere materialer - mikrobiel vækst

8 Undersøgelse af udvalgte materialer

Vækstkurverne for P17 i ekstrakterne (serie 1) kunne ikke direkte omsættes til en AOC-værdi for afgivelsen fra de enkelte materialer på samme måde som i tidligere undersøgelser. Dels var der i nogle tilfælde store afvigelser mellem de enkelte triplikater, og dels svarede vækstkurverne ikke til de tidligere, idet maksimale bakterieantal generelt blev opnået senere i vækstforløbet. Desuden var P17 antallet i en del af ekstrakterne lavere end i blindprøverne. For at undersøge om en hæmningseffekt (f.eks. tilstedeværelsen af toksiske forbindelser) kunne forklare de opnåede vækstkurve, blev alle ekstrakterne dag 29 podet med 100 CFU/L P17 for at påvise tilstedeværelse af P17 (før kimtalsbestemmmelse dag 29) og tilsat 1 mL acetatopløsning til en slutkoncentration på ca. 20 mg acetat-C/L. Såfremt der ikke var nogen faktorer, som hæmmede væksten af P17, skulle dette resultere i en tilvækst i AOC på omkring 20 mg acetat-C/L. Bakterieantallet blev bestemt 3 og 5 døgn efter tilsætningen af acetat. Vækstkurver for P17 i ekstrakterne, maksimale AOC_P17-værdier samt tilvæksten som følge acetattilsætningen ses angivet som serie 1 i Bilag E. Der var ikke entydig sammenhæng imellem hvilke ekstrakter, der havde resulteret i lavere P17 koncentrationer end blindprøverne og hvilke ekstrakter, der gav et lavere antal P17 end forventet som følge af acetattilsætningen. Det var derfor ikke umiddelbart til at konkludere, om resultaterne skyldes tilstedeværelsen af toksiske forbindelser.

Da der var flere faktorer, der viste sig anderledes end forventet i undersøgelsen af de fem materialer, blev forsøget gentaget 3 måneder senere (serie 2) med de samme materialer fra samme bacth som i den første undersøgelse. Materialerne havde siden modtagelse fra producenterne været opbevaret indpakket i stanniol ved stuetemperatur. Ekstrakterne blev dag 20 tilsat 1 mL acetatopløsning til en slutkoncentration på ca. 25 mg acetat-C/L for at undersøge tilstedeværelse af hæmmende forbindelser. Vækstkurver for P17 i ekstrakterne, maksimale AOC_P17-værdier samt tilvæksten som følge acetattilsætningen ses angivet som serie 2 i Bilag E. Der var samme problemer med manglende overensstemmelse imellem triplikater og imellem ekstrakter af materialer og blindprøver som under serie 1, og der blev heller ikke set den forventede tilvækst ved tilsætningen af acetat. De to seriers blindværdier stemte overens, men der var ikke videre overensstemmelse imellem opnåede AOC_P17-værdier fra serie 1 og serie 2 (jævnfør Tabel 16).

Der blev ikke konstateret kontamineringer med uønskede bakterier ved kimtalsbestemmelserne på R2A-agar med en inkubationstid på 2-3 døgn ved 25° C (senere undersøgelser viste dog, at kontaminerende bakterier først voksede frem på R₂A-agar, når inkubationstiden blev forlænget til 9-14 døgn , jævnfør Bilag G).

ATP (adosine triphosphat) findes i alle levende celler og fungerer som cellernes energilager. ATP er således et indirekte mål for bakterieantallet (jævnfør analyseprincip og metode i Bilag F).

ATP-indholdet i prøver fra dag 0 for serie 1 og 2 blev analyseret for at afklare, om de afvigende resultater kunne tilskrives en kontaminering med uønskede bakterier. ATP-niveauer £ 5 pg ATP/mL er normalnivauet for en ikke-kontamineret drikkevandsprøve podet med P17. De målte ATP-værdier ses i Tabel 16 sammen med de i ekstakterne opnået AOC_P17-værdier.

Tabel 16:
AOC_P17-værdier i ekstrakter af polymert materiale (blindværdi ikke fratrukket) samt tilhørende ATP-værdier for dag 0. Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn med omrystning, mens væksten af P17 foregik ved 15° C. Skraverede værdier angiver ekstrakter, der har været kontamineret med uønsket bakterier under ekstraktionen.

De forhøjede ATP-værdier for nogle af ekstrakterne viste, at de havde været kontamineret med uønskede bakterier under ekstraktionen, og det var konsekvent disse ekstrakter, hvor AOC_P17-værdi var lavere end forventet. Dette kan forklares ved, at de kontaminerende bakterier havde opbrugt det tilgængelige substrat, eventuelt allerede under ekstraktionen, så P17 ikke kunne vokse i ekstraktet. Da de kontaminerende bakterier voksede langsommere end P17 på agarpladerne gav de kontaminerende bakterier ingen synlige kolonier ved kort tids inkubering af agarpladerne. ATP-målingen kunne derimod påvise bakteriernes tilstedeværelse.

Ingen af blindprøverne var kontamineret, hvilket kunne tyde på at problemet med overlevelse af uønskede bakterier var forbundet med tilstedeværelsen af materialet. Da tidligere undersøgelser havde været udført med samme batch PEM materialer (hvor der ikke havde været kontamineringer), måtte problemet med overlevelse af uønskede bakterier kunne tilskrives en ændring i det leverede vand - enten selve testvandet eller det postevand, der anvendes til skylning af testmaterialet inden ekstraktionen. Da uønskede bakterier også havde overlevet under undersøgelsen med sekventielle ekstraktioner (jævnfør Kapitel 6), men blev inaktiveret ved at hæve pasteuriseringstiden, blev effekten af forskellige pasteuriseringsforhold og kloring på de uønskede bakterier undersøgt (Bilag G). De pågældende bakterier kunne inaktiveres ved pasteurisering (70° C, 30 min) i vand uden materiale, men kunne overleve, når de blev pasteuriseret i vand med materiale tilstede. Denne observation bekræftede den generelle opfattelse af, at bakterier er mere modstandsdygtige, når de er fasthæftede. Ud fra den udførte undersøgelse blev det besluttet at gentage undersøgelsen af de fem materialer, idet pasteuriseringen blev ændret til 70° C i 30 min. AOC_P17-værdier i ekstrakterne samt ATP-værdier for dag 0 ses i Tabel 16.

Figur 23:
Vækstkurver for P17 i ekstrakter af 5 forskellige polymere materialer og tilhørende blindprøver afbilledet dels som AOC og dels som ATP (kontaminerede prøver sorteret fra). Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn med omrystning, mens væksten af P17 foregik ved 15° C.

På trods af ændringen af pasteuriseringen var der i serie 3 fortsat problemer med kontaminering med uønskede bakterier under ekstraktionen. Dog var det en langt mindre del af de uønskede bakterier, der havde kunnet klare den kraftigere pasteurisering, da ATP-værdierne var langt lavere i de kontaminerede ekstrakter i serie 3 end i de to forgående serier. Desuden blev ATP målt i de ikke-kontaminerede ekstrakter fra serie 3 for alle dage hvor der blev bestemt kimtal. Vækstkurver for P17 er afbilledet dels som AOC og dels som ATP i Figur 23 (ATP-data er angivet i Bilag E). Både målt som CFU og AOC var der markant højere AOC_P17 i alle ekstakterne end i blindprøverne. Den gode overensstemmelse imellem de sammenhørende kurver for AOC og ATP indikerer, at ATP-målinger måske vil kunne erstatte kimtalsbestemmelser.

Tabel 17:
AOC_P17-værdier opnået i ekstakter af fem polymere materialer (fratrukket respektive gennemsnitlige blindværdier). Gennemsnit er angivet som aritmetiske gennemsnit med standardafvigelser. Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn med omrystning, mens væksten af P17 foregik ved 15° C. Værdier i parenteser indgår ikke i beregning af snit.

Ud fra AOC_P17-værdierne fra ikke-kontamineret ekstrakter fra de tre serier, blev bestemt et gennemsnit for afgivelsen fra de fem materialer på trods af, at der ikke var triplikate værdier for alle materialer fra én serie (Tabel 17). AOC_P17-værdier for de enkelte ekstrakter blev fratrukket den gennemsnitlige blindværdi for de respektive serier inden beregning. To AOC_P17-værdier for henholdsvis blå og sort PEM var afvigende høje (markeret med parentes i Tabel 17). Disse værdier indikerede en forurening med eksternt kulstof (Kap. 3.3.2), og indgik derfor ikke i beregningen af gennemsnit. Da de enkelte ekstrakter stammede fra forskellige serier (med forskellige blindværdier) kunne en gennemsnitlige AOC_P17-værdi ikke bestemmes som beskrevet i Kapitel 3, og i stedet blev det aritmetiske gennemsnit bestemt. Der var en tendens til at der blev opnået højere værdier i ekstrakter af PEM og PVC(org.) end i metalstabiliseret PVC, men på grund af variationen mellem ekstrakterne var disse forskelle ikke signifikante. Der blev målt afgivelser på mellem 27 og 41 mg acetat-C/L svarende til en flux på 3,5-5,5´ 10^-3 mg acetat-C/d/cm².

Værdierne for de to PEM materialer svarer til, hvad der blev set ved tidligere undersøgelser: Fra undersøgelsen af syv S/V-forhold blev der for blå PEM₍₂₎ under tilsvarende testforhold ved et S/V-forhold på 0,55 cm^-1 opnået en værdi for afgivelsen på 31 mg acetat-C/L; for sort PEM blev der ved undersøgelsen af sekventielle ekstraktioner (ekstraktion ved 10° C) opnået 34 mg acetat-C/L i det første ekstrakt på trods af kontaminering med en uønsket bakteriestamme.