| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Hormonforstyrrende effekter af kombinationer af pesticider

1 Introduktion og baggrund

• 1.1 Baggrund
• 1.2 Projektets formål
• 1.3 Hypotese og strategi for delprojekt 1
• 1.4 Hypotese og strategi for delprojekt 2

1.1 Baggrund

Unormal kønsdifferentiering i vildtlevende dyr, stigningen i forekomsten af testikelkræft, øget forekomst af misdannede kønsorganer og forringet sædkvalitet hos drenge/mænd og den fortsatte stigning i forekomsten af brystkræft hos kvinder er årsag til udbredt bekymring (Sharpe and Skakkebæk 1993; Toppari et al. 1996; Crisp et al. 1998). Der er mistanke om, at disse effekter er relateret til eksponering for miljøkemikalier, som er i stand til at efterligne eller blokere effekterne af de endogene hormoner. Listen over kemikalier, der har vist sig at have østrogen aktivitet, er vokset betydeligt indenfor de senere år og inkluderer nu stoffer så forskellige som o,p-DDT, methoxychlor, non-coplanare PCBer, bisphenol A og alkoxyphenoler (Crisp et al. 1998). Der er evidens for, at nogen af disse kemikalier forårsager skadelige effekter i vildtlevende dyr, men forsøg på at etablere et link mellem human sundhedsrisiko og eksponering for østrogene kemikalier kompliceres af den kendsgerning, at mange af de mistænkte kemikalier har meget lav østrogen potens sammenlignet med 17β-østradiol samt, at stofferne findes i ukendte blandinger i de eksponerede individer.

I de senere år har flere stoffer i cellekulturforsøg og i dyreforsøg vist sig at have antiandrogen virkning (Gray et al., 1999). De fleste hormonforstyrrende kemikalier er svage agonister eller antagonister af kønshormon-receptorerne og er effektive ved koncentrationer i M-området in vitro og er således flere 1000-gange mindre potente end de naturlige kønshormoner. Det er derfor vanskeligt at forklare de mulige sundhedsrisici alene på basis af toxiciteten af enkeltstoffer. Situationen kompliceres dog af, at miljøkemikalier ikke inducerer og bindes til forskellige plasmaproteiner, som tilfældet er for de endogene hormoner. Denne proteinbinding har stor betydning for den biologiske aktivitet, hvorfor man ikke kan vurdere det hormonforstyrrende potentiale af miljøkemikalier ved direkte at sammenligne serumkoncentrationer af disse og endogene hormoner. Den humane population er eksponeret for blandinger af hormonforstyrrende stoffer med en række forskellige virkningsmekanismer og det er sandsynligt at disse kemikalier spiller sammen på en måde så de samlede hormonale effekter er større end for enkeltsofferne alene. Derfor er studier af kombinationseffekter af pesticider et af de højt prioriterede områder indenfor pesticidforskningsområdet, hvilket også blev konkluderet i Bichel-rapporten (1999) udgivet af Miljøstyrelsen.

Mange pesticider har vist et potentiale for hormonforstyrrende effekt. Forskellige virkningsmåder er blevet foreslået:

1. Østrogenicitet er vist in vitro for bl.a. endosulfan, o,p-DDT, toxaphener, dieldrin, methoxychlor, chlordecon, methiocarb, chlorpyrifos og fenarimol (Soto et al. 1995; Jørgensen et al. 1997; Andersen et al. 2002). Kun få af disse stoffer, så som methoxychlor (Cummings, 1997) og o,p-DDT (Ottoboni et al. 1977), er blevet bekræftet at have in vivo østrogen aktivitet.
2. Antiandrogene effekter både in vitro og in vivo er blevet vist for bl.a. p,p'-DDE, linuron, vinclozolin og procymidon (Gray et al. 1999; Kelce and Wilson, 1997; Vinggaard et al. 1999).
3. Ændret testosteronmetabolisme enten ved hæmning af dets syntese eller ved at inducere dets nedbrydning er vist for ketoconazol, endosulfan, mirex, chlordecon og o,p-DDT (LeBlanc, 1997).
4. Aromatasehæmning er fundet for prochloraz og fenarimol (Vinggaard et al. 2000) og aromataseinduktion for triazin herbicider som atrazin og simazin (Sanderson et al. 1999), p,p-DDT (You et al. 2001) samt nogle karbamat-insekticider (Andersen et al. 2002).

Det vil sige, at adskillige virkningsmåder og mekanismer kan være involverede i hormonforstyrrelser forårsaget af pesticider. Da befolkningen bliver eksponeret for en blanding af pesticider, er det yderst relevant at teste samspilseffekter af pesticider med både samme og forskellig virkningsmekanisme i nogle af de tests der dels er foreslået som OECD guideline tests og dels kan tænkes at blive anbefalet til test for hormonforstyrrende effekter.

Den systematiske analyse af kombinationseffekter af hormonforstyrrende stoffer er kun lige begyndt. M.h.t. effekterne af blandinger af hormonforstyrrende stoffer har det primære fokus hidtil været på den østrogene aktivitet af blandinger i cellekulturer (Soto et al. 1994; Sumpter and Jobling, 1995; Bergeron et al. 1994; Arnold et al. 1996; Ramamoorthy et al. 1997; Wade et al. 1997; Soto et al. 1997). Specielt én artikel, der rapporterede om dramatiske synergistiske effekter på østrogen receptor aktivering med kombinationer af pesticider (Arnold et al.1996) forårsagede stor videnskabelig, regulatorisk og offentlig bekymring rundt om i verden. Men da eksperimenterne viste sig ikke at kunne reproduceres (Ramamoorthy et al. 1997; Gaido et al. 1997), blev artiklen trukket tilbage (McLachlan, 1997). Ved undersøgelse af de kombinerede effekter af østrogene stoffer er der i mange tilfælde anvendt et eksperimentelt design, hvor de enkelte stoffer så vel som blandinger udelukkende blev testet ved ét dosisniveau (Soto et al. 1994; Sumpter and Jobling 1995; Arnold et al. 1997; Soto et al. 1997). Denne fremgangsmåde er intuitivt tillokkende men giver ikke det fulde billede af eventuelle samspilseffekter, fordi den kun tillader vurdering af kombinationseffekter, som er baserede på forventninger om effektsummation. Imidlertid er anvendelsen af metoden baseret på effektsummation begrænset til kombinationer af stoffer, som producerer lineære dosis-respons kurver der går igennem nulpunktet af dosis-effekt plottet og disse ses sjældent indenfor toksikologien (Kortenkamp and Altenburger, 1998). De kan forekomme i lav-dosis området af ellers ikke-lineære kurver som for carcinogener. I de fleste af de ovenfor nævnte studier er lineære dosis-respons forhold ikke blevet vist. Derfor blev hovedparten af studierne fundet at være inkonklusive (Kortenkamp and Altenburger 1999). De fleste studier konkluderer, at der synes at være additive effekter, d.v.s. ingen interaktion mellem stofferne, skønt en detaljeret mekanistisk analyse altså sjældent er foretaget. Der er dog eksempler på studier, som har overset synergistiske effekter, hvilket blev demonstreret ved en efterfølgende detaljeret vurdering af data (Kortenkamp and Altenburger, 1998).

I de seneste år er der udført nogle detaljerede og grundige studier over samspilseffekter mellem østrogene kemikalier in vitro af Kortenkamp og medarbejdere i London, UK (Payne et al. 2000; Rajapakse et al. 2001; Payne et al. 2001; Silva et al. 2002; Rajapakse et al. 2002). Sammenfattende konkluderer disse studier, at stoffer, der virker via samme virkningsmekanisme, virker additivt in vitro når data bliver analyseret ved hjælp af koncentrations-additionsmodellen eller isobolmetoden. De nævnte studier viser desuden, at koncentrations-additionsmodellen er bedre til at prædiktere kombinationseffekter i denne type undersøgelser end andre modeller som anvendes til at analysere kombinationseffekter. Koncentrations-additionsmodellen kræver ikke liniære dosis-responskurver, men bygger på en antagelse om, at effekten af en blanding af stoffer ikke ændres hvis et af stofferne erstattes med en 'iso-effektiv' dosis af et andet stof med samme virkningsmekanisme.

Hovedparten af det arbejde, der er lavet indenfor området er baseret på in vitro experimenter, der lider af de velkendte begrænsninger som mangel på vurdering af absorption, metabolisme og ekskretion. Meget få in vivo eksperimenter på blandinger af hormonforstyrrende stoffer er blevet udført. Det er vist at kombinationseffekten varierer i det samme eksperimentelle system afhængig af det valgte endpoint (Altenburger et al. 1993). Stoffer som virker synergistisk på det molekylære niveau (e.g. receptor binding) kan udvise additivitet, når der måles på endpoints på mere komplekse funktionelle niveauer såsom cellevækst eller celledød (Grimme et al. 1996). Af denne grund er det vigtigt at udføre analyse af kombinationseffekter af hormonforstyrrende stoffer ved forskellige niveauer af molekylær kompleksitet inklusive in vivo studier.

1.2 Projektets formål

Ideen med nærværende projekt var for det første at udføre in vitro og in vivo undersøgelser, der fokuserede på detaljeret at belyse typen af interaktion mellem pesticider med kendt hormonforstyrrende effekt (Delprojekt 1). Pesticiderne blev valgt som modelstoffer og bliver ikke længere anvendt i Danmark.

Formålet med det andet delprojekt var at udføre in vitro og in vivo undersøgelser med kombinationer af pesticider, som er i almindelig anvendelse i Danmark og for hvilke der er fundet svage in vitro hormonforstyrrende effekter (Delprojekt 2).

1.3 Hypotese og strategi for delprojekt 1

Formålet med dette delprojekt var at undersøge interaktion af kendte potente pesticider, som fra in vivo og forskellige in vitro eksperimenter vides at have hormonforstyrrende effekter. Pesticider med formodet samme virkningsmekanisme blev kombineret og samspilseffekten belyst både in vitro samt in vivo i rotteforsøg. Desuden er kombinationseffekter for tre pesticider, som ikke har samme virkningsmekansime, undersøgt in vitro. Dosis-respons kurver for henholdsvis østrogene eller antiandrogene effekter af hvert enkelt stof og af blandingerne er undersøgt. Data er efterfølgende analyseret og fortolket ved hjælp af isobolmetoden, der bygger på koncentrations-additionsprincippet. Serum fra pesticideksponerede rotter er desuden undersøgt for østrogen aktivitet in vitro, efter fjernelse af de naturlige østrogener fra prøven. Ved at sammenligne resulaterne fra disse målinger med resultater fra in vitro undersøgelserne af de rene pesticider og med de øvrige resultater fra rotteforsøgene, er det muligt at vurdere værdien af denne nye biomarkørmetode. De valgte parametre i in vivo undersøgelserne inkluderer effekter på morfologi, hormonniveauer, genekspression og neurokemiske parametre.

1.4 Hypotese og strategi for delprojekt 2

Strategien for dette delprojekt var at undersøge en blanding af nogle almindeligt anvendte pesticider i Danmark, for hvilke der er fundet svage hormonforstyrrende effekter in vitro. Disse pesticider er relevante fra både et miljømæssigt synspunkt (dvs. ansatte i gartnerier, hvor stofferne anvendes) og fra et forbrugersynspunkt. For disse individuelle stoffer er der ikke nogen viden om hormonforstyrrelser in vivo, men de er alle blevet testet for østrogene, (anti)androgene og aromatasehæmning in vitro (Andersen et al. 2002) og de udviser effekt i mindst et af assayene. Kun i in vitro forsøgene og ikke i in vivo studierne blev der lavet komplette dosis-respons kurver for de enkelte stoffer, hvilket betyder, at der ikke opnås et fuldt billede af interaktionen mellem stofferne in vivo. Blandingen er testet for antiandrogen aktivitet in vitro og in vivo. Derudover er blandingen testet i et in utero eksperiment, hvor adskillige parametre i det hanlige afkom er inkluderet.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Juni 2004, © Miljøstyrelsen.