| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Bæredygtig produktion af småplanter i forstplanteskoler

4 Analyser

• 4.1 Planteparametre
  • 4.1.1 Fremspiring, dødelighed, antal høstede planter og udbytte
• 4.2 Registrering af ukrudt
• 4.3 Forekomst af rodpatogener
  • 4.3.1 Jordtest
  • 4.3.2 Isolering og identifikation af svampe fra markforsøgene
  • 4.3.3 Patogenitetstest
• 4.4 Undersøgelse af mykorrhiza
  • 4.4.1 Ektomykorrhiza
  • 4.4.2 Arbuskulær mykorrhiza
• 4.5 Fedtsyreanalyser til karakterisering af jordmikrofloraen
• 4.6 Statistiske analyser

4.1 Planteparametre

4.1.1 Fremspiring, dødelighed, antal høstede planter og udbytte

I hver parcel indenfor hver planteart blev en cirkel (0,25 m²) lagt i midten af afgrøden, og alle plantemålinger blev foretaget i dette fastlagte areal. Seks uger efter såning, blev der målt fremspiring af frø. Herefter blev planter med symptomer på rodråd registreret 10 og 14 uger efter såning og endelig 28 uger efter såning blev alle planter indenfor cirklen nænsomt gravet op, og planterne blev bragt til laboratoriet, rødderne vasket fri for jord og planterne talt og vejet. Grundet problemer med overslæb af frø mellem parceller ved etablering af forsøget på Akkerup Planteskole er plantedata for Akkerup ikke pålidelige og derfor ikke medtaget i denne rapport.

4.2 Registrering af ukrudt

Fremspiring af ukrudt blev registreret ved at kaste en cirkel (50 cm i diameter) tre tilfældige steder i hver parcel og indenfor cirklen blev art, antal og vægt af alle fremspirede planter registreret ca. en måned efter forsøgene blev anlagt.

4.3 Forekomst af rodpatogener

4.3.1 Jordtest

Testen havde til formål at undersøge sygdomstrykket i jorden på nordmannsgran, sitkagran, nobilisgran og hvidel. Der blev anvendt frø fra samme frøparti som i markforsøgene. Testen blev udført som et fuldfaktor randomiseret blokdesign med tolv gentagelser i drivhus. Planterne blev dyrket i 2 kg potter i den rå jord indhentet fra planteskolerne umiddelbart før start af markforsøg. Inden parcelafsætning i markforsøgene blev 10 spadestik jord tilfældigt fra hver af de 4 blokke udtaget. Jorden fra hver enkelt blok blev blandet og anvendt til jordtest. Femten frø blev lagt på overfladen af den rå jord i hver potte og derefter dækket med 100 g kalkfrit sand. Potterne blev dækket med plastik indtil fremspiring. Antallet af spirede og døde planter blev optalt løbende.

4.3.2 Isolering og identifikation af svampe fra markforsøgene

Fra hver parcel i begge planteskoler blev der indhentet 10 syge og 5 sunde planter af hver planteart. Rødderne fra den enkelte plante blev vasket og klippet i 1 cm stykker. Fire rodstykker fra hver plante blev overfladesteriliseret i 70 % ethanol, skyllet 3x i dobbeltdestilleret autoklaveret vand og lagt på Potato Dextrose Agar (PDA) med novobiocin (25 mg l^-1) for detektion af svampe. Efter fremvækst blev svampene inddelt og optalt i grupper efter visuel bedømmelse (vækst, struktur og farve) og repræsentanter fra de enkelte svampe rendyrket på PDA. Pythium lignende svampe dog på P₁₀VP (Corn meal agar med brassicol 100 mg l^-1, ampicillin 250 mg l^-1, pimaricin mg l^-1og rifampicin 10 mg l^-1). Derefter blev svampene identificeret i mikroskopet ved hjælp af følgende værker: Barron, 1968; Booth, 1971; Dick, 1990; Domsch et al., 1980a; Domsch et al., 1980b; Ellis, 1971; Sutton, 1980; von Arx, 1970.

4.3.3 Patogenitetstest

De isolerede svampe fra de to planteskoler blev dyrket op på PDA (Pythium på P₁₀VP) og to tæt bevoksede plader af hver svamp blev anvendt i patogenitetstesten. Indholdet på de to plader blev blendet med 100 ml destilleret sterilt vand og blandet i 2 kg steril (autoklaveret) jord:sand (1:2) blanding. Fem forspirede frø af nordmannsgran (samme frøparti som blev anvendt i markforsøgene) blev lagt på 200 g af den inokulerede jord:sand blanding i en potte (n=8) og dækket med 20 g kalkfrit sand. En kontrolbehandling uden svamp blev inkluderet i forsøget.

Planterne blev dyrket i væksthus med dag/nat på 16/8 timer og temperatur 20/18°C. Fremspiring af planter blev registreret efter 3 uger, og antallet af fremspirede men døde planter blev registreret efter 3, 4 og 6 uger. Fire uger efter såning blev fire syge planter fra hvert svampeisolat udtaget og rodstykker overfladesteriliseret og lagt på PDA (P₁₀VP), som beskrevet under isolering af svampe for reisolering og identifikation af svampene.

4.4 Undersøgelse af mykorrhiza

4.4.1 Ektomykorrhiza

For at få indblik i mykorrhizafloraen på de to planteskoler blev der før forsøgsstart indhentet og analyseret planter (Picea abies (20 stk.), Abies alba (20 stk.), Fagus sylvatica (2 stk.)) fra Akkerup Planteskole. Rødderne blev vasket og undersøgt for tilstedeværelsen af ektomykorrhiza ved hjælp af lysmikroskopi. De blev inddelt på basis af morfotyper (farve og tekstur, samt tilstedeværelse af eksternt mycelie på svampekappen). Fra udvalgte rodspidser med mykorrhiza blev tynde snit mikroskoperet med henblik på at artsbestemme svampene mikroskopisk. Identifikation ved hjælp af Ingleby et al. (1990).

Ved høst blev rødder af nordmannsgran fra alle 11 behandlinger klippet i 1-2 cm stykker og undersøgt for forekomst af ektomykorrhiza ved hjælp af lysmikroskopi. Procent rodspidser med mykorrhiza blev målt ved at mikroskopere 200 tilfældige rodspidser og beregne andelen af rodspidser med mykorrhiza. Desuden blev intensiteten af mykorrhiza koloniseringen målt med svampemarkøren ergosterol. Til dette formål blev der udtaget 5 g delprøve, som blev frysetørret og formalet med kuglekværn. 25 mg prøve blev udtaget og ekstraheret og målt for ergosterol som ifølge Nylund & Wallander (1991).

4.4.2 Arbuskulær mykorrhiza

Ti tilfældige hvidel planter blev udtaget fra de ubehandlede parceller i begge planteskoler og i alle parceller i Akkerup Planteskole. Rødderne blev vasket under rindende vand og klippet i 1 cm stykker. Rodstykkerne blev klaret først i 3 timer i 10 % KOH i vandbad ved 90 °C. KOH 10 % blev skiftet efter 1 time. Dernæst blev rødderne bleget i en 25 % NH₄OH opløsning og 10 % H₂O₂ i vand i 2 timer ved stuetemperatur. NH₄OH og H₂O₂ opløsningen blev skiftet efter en time. Derefter blev rodprøverne yderligere klaret i 10 % H₂O₂ i 1½ time, hvorefter de blevet farvet med 5 % trypanblå i 5 min. ved 90 °C. Rodstykker fra samme parcel blev grundigt blandet, tre delprøver udtaget og lagt på objektglas til mikroskopi. Præparaterne blev mikroskoperet ved 100x forstørrelse, og ± mykorrhiza blev registreret i 100 tilfældige punkter i roden. Koloniseringsprocenten for den enkelte parcel er et gennemsnit af registreringer af de tre præparater og for den enkelte behandling gennemsnittet af de fire parceller.

4.5 Fedtsyreanalyser til karakterisering af jordmikrofloraen

Metoden som blev anvendt er baseret på ekstraktion af den totale mængde af fedtsyrer fra jordprøven. Disse fedtsyrer findes i alle levende organismer; primært som delkomponenter i membranlipider og i lipider til oplagsnæring. Der findes mange forskellige fedtsyrer, der varierer i længde (antal C atomer), forgreninger i C kæden, mætning (med og uden dobbeltbindinger) og tilknytning af hydroxy- og methylgrupper. På baggrund af viden om fedtsyresammensætninger hos forskellige mikroorganismer (se tabel 1) giver sammensætningen og koncentrationen af fedtsyrer i jorden både kvalitativ og kvantitativ information om mikrobielle samfund i jord. Metoden anvendes primært til identifikation af bakterier, men kan også anvendes som i dette projekt til beskrivelse af mikrobielle samfund i jord (Cavigelli et al., 1995). Metoden er baseret på frigørelse af fedtsyrer fra jordprøven med en stærk base kombineret med varme, hvor fedtsyrerne bliver spaltet fra deres lipider og omdannes til deres natrium-salt. Herefter methyleres fedtsyrerne til fedtsyremethylester, som forøger flygtigheden af fedtsyrerne til GC-analyse. Efter ekstraktion og basevask er prøverne klar til GC-kørsel. Gaskromatografen er fuldautomatisk og kan opbevare op til 99 prøver ad gangen. Hver prøve tager ca. 25 min. at analysere. 2 μl prøve injiceres, den fordampes, og dampen bæres gennem en 0,2 mm tyk og 25 m lang silica belagt kolonne med et flow af hydrogen gas. Kortkædede fedtsyrer vil passere kolonnen hurtigere end langkædede fedtsyrer. Hydroxylerede fedtsyrer er langsommere end cyclopropylerede eller forgrenede fedtsyrer osv. Så en specifik fedtsyre vil nå gennem kolonnen til detektoren på en specifik retentionstid afhængig af de fysiske egenskaber, og computeren vil via softwareprogrammet MIDI navngive den specifikke fedtsyre og måle intensiteten af signalet for kvantificering. Til kvantificering af de enkelte fedtsyrer er der indlagt en intern standard, som ikke forekommer naturligt.

Tabel 1. Oversigt over udvalgte fedtsyresignaturer.

4.6 Statistiske analyser

Alle forsøgsresultater blev underkastet envejs variansanalyse med behandlinger som faktor. Forskelle mellem behandlinger blev testet med LSD_0.05 , såfremt variansanalysen gav signifikant behandlingseffekt. Inden variansanalyse blev data testet for normalfordeling og varianshomogenitet. Programmet StatGraphics Plus blev anvendt til de statistiske analyser.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 November 2004, © Miljøstyrelsen.