| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Undersøgelse for Legionella i drikkevand

Bilag B

Forforsøg, flowskema og beskrivelse af mod. DS 3029


  Med det samme
  Efter 48 timer		  
  Rystebord, 1 t, IIa   -   I
  ↓   -  
  Udså 0,1 ml på GVPC og MWY   Udså 0,1 ml på GVPC og MWY  
  ↓   ↓  
  2,0 ml af IIa i eppendorfrør   3 x 2,0 ml af IIa i eppendorfrør   II
  ↓   ↓  
  Centrifugeres   Centrifugeres  
  ↓   ↓  
  Fjern 1,7 ml   Fjern 1,7 ml fra rør 1
  Fjern 1,7 ml fra rør 2
  Fjern 1,8 ml fra rør 3		  
  ↓   ↓  
  Whirlmix og udså 0,1 ml på
  GVPC og MWY		   Whirlmix og udså 0,1 ml på
  GVPC og MWY fra rør 1		  
    ↓  
    Rør 2 sættes i vandbad
  50°C, 30 min →		   Udså 0,1 ml på
  GVPC og MWY
  IV
    ↓  
    Rør 3 tilsættes 1,8 ml syrebuffer  
    ↓  
    Henstår 5 min  
    ↓  
    Whirlmix og udså 0,1 ml på
  GVPC og MWY
 		   III

Alle plader inkuberes og aflæses som flg.:

INKUBERING
37,0 ± 1,0°C i lukkede plastposer.

AFLÆSNING
Aflæs efter ca. 4 og ca. 7 dage. Slutaflæs efter 10 dage.
Typiske kolonier er konvekse, helrandede, glinsende med kornet overflade (”Knust glas”) – se evt. under stereomikroskop. Grå, hvide, blå-violette eller lime-grønne. Nogle kan fluorescere. Kolonierne er små (pin-point) efter 2 – 3 dage, men vokser derefter til ca. 3 – 4 mm. Ved mikroskopi ses tynde, slanke stave op til filamentøse.

VERIFIKATION
Indgik ikke i forforsøg, da der ikke var fund af suspekte Legionella.

Fire trin indgår i analysen af vandprøver

  • I. Membranfiltrering (1. opkoncentrering): 10 l, 50 l og 100 l filtreres på vandværket, og filter overføres til bluecapflaske med hhv. 10 ml, 10 ml og 50 ml sterilt ledningsvand. Flasken rystes på rystebord ved 200 rpm i 60 ± 5 minutter. Herved koncentreres prøven hhv. 1.000 X, 5.000 X og 10.000 X. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC og MWY agar.
     
  • II. Centrifugering (2. opkoncentrering): 2 ml af den opkoncentrerede prøve (I) afpipetteres i et sterilt Eppendorfrør, der centrifugeres ved 8000 g i 5 ± 0,5 minutter. Efter centrifugering afpipetteres (fjernes) 1,7 ml supernatant. Herved opkoncentreres prøven yderligere 6,7 X. Den resterende prøvemængde (0,3 ml) rystes på whirlmixer. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC og MWY agar.
     
  • III. Syrebehandling: 2 ml af den opkoncentrerede prøve (I) afpipetteres i et sterilt Eppendorfrør, der centrifugeres ved 8000 g i 5 ± 0,5 minutter. Efter centrifugering afpipetteres (fjernes) 1,8 ml supernatant. Herved opkoncentreres prøven yderligere 10 X. Den resterende prøvemængde (0,2 ml) rystes på whirlmixer. Til de 0,2 ml tilsættes 1,8 ml syrebuffer pH 2,2. Herved fortyndes prøven 10 X. Henstand ved stuetemperatur i 5 ± 0,5 minutter. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC og MWY agar.
     
  • IV. Varmebehandling: 2 ml af den opkoncentrerede prøve (I) afpipetteres i et sterilt Eppendorfrør, der centrifugeres ved 8000 g i 5 0,5 minutter. Efter centrifugering afpipetteres (fjernes) 1,7 ml supernatant. Herved opkoncentreres prøven yderligere 6,7 X. Den resterende prøvemængde (0,3 ml) rystes på whirlmixer. Røret sættes i vandbad ved 50 ± 1°C i 30 ± 2 minutter. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC og MWY agar.

Prøver af biofilm og filtermateriale

  • Svabere udstryges direkte på plader med GVPC og MWY agar. Svabere lægges i bluecapflaske med ledningsvand og efter henstand ved stuetemperatur i 48 timer udføres de fire ovenstående trin.
  • Fra filtermateriale udføres direkte udsæd efter rystebord (trin I): 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC og MWY agar. Hvis konsistensen tillader det, foretages direkte udsæd fra den ufortyndede prøve ellers fra fortyndet prøve.
  • II. Centrifugering, III. Syrebehandling og IV. Varmebehandling: Foretages som til analyse af vandprøven med den modifikation, at der afpipetteres 2 ml fra filtermaterialets vandige del.

Pladerne inkuberes ved 37 ± 1°C og der aflæses efter 4, 7 og 10 dage.

 

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |



Version 1.0 Marts 2005, © Miljøstyrelsen.