| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Undersøgelse for Legionella i drikkevand

Bilag F

Screening af ledningsvand, flowskema

Den endelige screening af ledningsvand
Flowskema og beskrivelse af modificeret DS 3029


  Med det samme		  
  Rystebord, 1 t, IIa   I
  ↓  
  Udså 0,1 ml på GVPC  
↓  
  2,0 ml af IIa i eppendorfrør   II
  ↓  
  Centrifugeres  
  ↓  
  Fjern 1,6 ml fra rør  
  ↓  
  Whirlmix og udså 0,1 ml på GVPC  
  ↓  
  Røret med 0,25 ml sættes i vandbad
  50°C, 30 min →		   udså 0,1 ml på GVPC
  IV
  ↓  
  Rør med 0,050 ml tilsættes 0,450 ml syrebuffer  
  ↓  
  Henstår 5 min  
  ↓  
  Whirlmix og udså 0,1 ml på GVPC   III
   
  Filter placeres i tom steril flaske og dækkes med syrebuffer   VI
  ↓  
  Henstår i 5 min  
  ↓  
  Filter på GVPC
 		  

Alle plader inkuberes og aflæses som flg.:

INKUBERING
37,0 ± 1,0°C i lukkede plastposer.

AFLÆSNING
Aflæs efter ca. 4 og ca. 7 dage. Slutaflæs efter 10 dage.
Typiske kolonier er konvekse, helrandede, glinsende med kornet overflade (”Knust glas”) – se evt. under stereomikroskop. Grå, hvide, blå-violette eller lime-grønne. Nogle kan fluorescere. Kolonierne er små (pin-point) efter 2 – 3 dage, men vokser derefter til ca. 3 – 4 mm. Ved mikroskopi ses tynde, slanke stave op til filamentøse.

VERIFIKATION
Min. 3 kolonier: vækst på BCYE, ingen vækst på BA, 37,0 ± 1,0°C, min. 2 døgn. Agglutination (L. pneumophila sg. 2-14 samt efter behov L. pneumophila sg. 1 og øvrige Legionella)

Fem trin indgår i analysen af vandprøver

  • I. Membranfiltrering (1. opkoncentrering): 10 l filtreres på vandværket og filter overføres til bluecapflaske med 20 ml sterilt ledningsvand. Flasken rystes på rystebord ved 200 rpm i 60 ± 5 minutter. Herved koncentreres prøven 500 X. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC agar.
     
  • II. Centrifugering (2. opkoncentrering): 2 ml af den opkoncentrerede prøve (I) afpipetteres i et sterilt Eppendorfrør, der centrifugeres ved 8000 g i 5± 0,5 minutter. Efter centrifugering afpipetteres (fjernes) 1,6 ml supernatant. Herved opkoncentreres prøven yderligere 5 X. Den resterende prøvemængde (0,4 ml) rystes på whirlmixer. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC agar.
     
  • III. Syrebehandling: 2 ml af den opkoncentrerede prøve (I) afpipetteres i et sterilt Eppendorfrør, der centrifugeres ved 8000 g i 5 ± 0,5 minutter. Efter centrifugering afpipetteres (fjernes) 1,6 ml supernatant. Herved opkoncentreres prøven yderligere 5 X. Den resterende prøvemængde (0,4 ml) rystes på whirlmixer. Til 50 l ml tilsættes 450 l syrebuffer pH 2,2. Herved fortyndes prøven 10 X. Henstand ved stuetemperatur i 5 ± 0,5 minutter. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC agar.
     
  • IV. Varmebehandling: 2 ml af den opkoncentrerede prøve (I) afpipetteres i et sterilt Eppendorfrør, der centrifugeres ved 8000 g i 5 ± 0,5 minutter. Efter centrifugering afpipetteres (fjernes) 1,6 ml supernatant. Herved opkoncentreres prøven yderligere 5 X. Den resterende prøvemængde (0,4 ml) rystes på whirlmixer. Et rør med 250 l sættes i vandbad ved 50 ± 1°C i 30 ± 2 minutter. 0,1 ml udsås på overfladen af GVPC agar.
     
  • VI. Syrebehandling af filtre: Filter placeres i tom steril flaske og dækkes med syrebuffer. Dette henstår i 5 min. Herefter lægges filter på GVPc agar.

Pladerne inkuberes ved 37 ± 1°C og der aflæses efter 4, 7 og 10 dage. Typiske kolonier (min. 3 stk.) verificeres ved vækst på BCYE og ingen vækst på BA ved 37,0 ± 1,0°C, min. 2 dage.

 

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |



Version 1.0 Marts 2005, © Miljøstyrelsen.