|
Test for human bioopløselighed af jordforureninger 2 Tidligere offentliggjorte undersøgelser af in vivo - in vitro sammenhæng
Der er, særligt indenfor de seneste år, offentliggjort et mindre antal undersøgelser af sammenhængen imellem in vivo biotilgængelighed og in vitro bioopløselighed af jordforureninger. Undersøgelserne har sædvanligvis været gennemført for et enkelt forureningsstof, med et begrænset antal jorde og med forskellige testmetoder. In vitro testmetodernes udformning er tidligere beskrevet /1/ med diskussion af fordele og ulemper ved de enkelte metoder, samt en principiel gennemgang af metoder til in vivo undersøgelse af jordforureningers biotilgængelighed /1/. Med henblik på at understøtte fortolkning og vurdering af data er i denne rapport suppleret med en kort opsummering og diskussion af de in vitro og in vivo metoder, der er benyttet til test af forurenede jorde, hvor der foreligger både in vivo og in vitro resultater. Der er i fremlæggelsen og diskussionen af in vivo og in vitro data for jordforureninger alene inddraget jorde, hvor begge typer af data foreligger og alene for de udvalgte jordforureninger: bly, cadmium, nikkel og PAH. 2.1 Benyttede in vitro test metoderI tabel 2.1 er vist principperne for de testmetoder, der er benyttet til in vitro test for human, oral bioopløselighed af jordprøver, hvor der også foreligger in vivo data. Hvor der foreligger in vitro bioopløselighedsdata bestemt med forskellige udformninger af metoderne, er i diskussionen i dette afsnit inddraget resultater opnået med den udformning, der kommer tættest på de metoder, der oprindeligt er indarbejdet og afprøvet til de danske undersøgelser: RIVM uden fødetilsætning (fastende) til metaller og RIVM med fødetilsætning (efter måltid) til organiske forureninger. For de fleste metoder til in vitro bestemmelse af bioopløselighed rapporteres bioopløseligheden som den del af en jordprøves totale indhold af forurening, der kan bringes i opløsning ved simulering af mave-tarmsystemet, dvs. som den absolutte bioopløselighed. Den absolutte bioopløselighed kan omregnes til den relative bioopløselighed som forholdet imellem den absolutte bioopløselighed af forureningen fra jordprøven og bioopløseligheden af en letopløselig referenceform af forureningen opnået i samme system, se afsnit 8 og 9.8. For både den absolutte og den relative bioopløselighed vil totalkoncentrationen af forurening i jorden indgå i beregningen. Variationer i målt totalkoncentration som følge af eksempelvis anvendelse af forskellige analysemetoder vil således forringe sammenligneligheden af bioopløselighedsdata. Tabel 2.1 Principper for testmetoder benyttet til in vitro test for human, oral bioopløselighed af jordprøver med in vivo data
I tabel 2.2 er vist bioopløselighed af bly og cadmium bestemt for 2 forskellige jordprøver med 3 forskellige testmetoder, /12/. Tabel 2.2 Bioopløselighed af bly og cadmium opnået for 2 forskellige jordprøver med 3 forskellige in vitro testmetoder, efter /12/
Det ses, at de benyttede metoder til test for bioopløselighed af jordforureninger er meget forskellige med hensyn til underliggende princip (enkel og robust eller fysiologisk realistisk) og udformning (med og uden tarm segment, med og uden fødetilsætning, simpel syreekstration eller sekventiel ekstraktion med sammensatte fordøjelsesvædsker). De relativt få sammenlignende undersøgelser tyder på, at bioopløseligheden afhænger af den valgte testmetode, samt at simple testmetoder uden tarm segment for f.eks. bly giver højere bioopløselighed end metoder, der simulerer fysiologiske betingelser med spyt, mave og tarm segment. 2.2 Benyttede in vivo undersøgelsesmetoderI tabel 2.3 er vist de undersøgelsesmetoder og forsøgsdyr, der er benyttet til in vivo undersøgelse af jordforureningers biotilgængelighed, sammen med en kort beskrivelse af principperne. Kun de forureninger/metoder/dyr, hvor der også foreligger in vitro data, er medtaget. De fleste metoder til undersøgelse af in vivo biotilgængelighed er udformet med henblik på at nå til et udtryk for den relative biotilgængelighed af jordforureningen i forhold til en letopløselig reference målt med samme metode. I metoderne får dyrene foder med forurenet jord tilsat, og indholdet af forureningen i dyrene måles efter en periode. Toksiciteten af jordforureningerne undersøges typisk ikke i disse forsøg. For PAH findes ikke en anerkendt metode til in vivo undersøgelse af stoffernes biotilgængelighed for dyr fra jord. Dette skyldes primært, at sådanne undersøgelser kompliceres af organiske stoffers omdannelse og nedbrydning. Ved forskning i medicins optag benyttes i reglen radioaktivt mærkede stoffer, hvor optag og skæbne af såvel moderstof som af omdannelses- og nedbrydningsprodukter kan følges. Denne fremgangsmåde lader sig ikke anvende til undersøgelser af organiske jordforureningers biotilgængelighed, idet tilsatte radioaktivt mærkede stoffer vil have en anden biotilgængelighed end stofferne bundet i jorden. Til undersøgelse af PAH forbindelsers biotilgængelighed er benyttet stoffer udskilt med fæces som et udtryk for ikke optagne PAH /14/, samt udskillelse af PAH metabolitter (f.eks.: 3-hydroxybenzo(a)pyren) i urinen som et udtryk for optaget PAH /19/. Den første metode vil medføre en overvurdering af biotilgængeligheden, fordi også nedbrudte og omdannede stoffer medregnes som biotilgængelige, mens den anden metode vil medføre en undervurdering af biotilgængeligheden, fordi kun en begrænset del af de optagne stoffer udskilles med urinen som de målte metabolitter. Supplerende er for PAH udviklet en metode, hvor in vivo biotilgængelighed undersøges i mus ved måling af koncentrationen af PAH bundet til DNA i lungevæv efter fodring af mus med forurenet jord og med jord tilsat et ekstrakt af den forurenede jord (DNA adduct metoden) /18/. For en enkelt jordprøve foreligger undersøgelser af in vivo biotilgængelighed af bly i forskellige forsøgsdyr, tabel 2.4. Desuden er der for 4 områder foretaget in vivo undersøgelser af forskellige jordprøver fra samme område, hvilket også er vist i tabel 2.4. Tabel 2.3 Forsøgsdyr og principper benyttet til in vivo undersøgelse af biotilgængelighed af jordprøver med in vitro data
Tabel 2.4 Resultater af in vivo undersøgelser af jordprøver for relativ biotilgængelighed af bly i forskellige forsøgsdyr /2;16;20/
Relative biotilgængeligheder opnået i de forskellige forsøgsdyr viser ikke umiddelbart overensstemmelse, men i vurderingen skal inddrages, at der kun i et enkelt tilfælde er tale om sammenligning af data opnået for samme jordprøve. I en større undersøgelse af metoder til stabilisering af bly i forurenet jord er der for den amerikanske miljøstyrelse, US EPA, foretaget test af udvalgte jordprøver i forskellige forsøgsdyr og mennesker. Der kunne ikke findes en entydig sammenhæng imellem den relative biotilgængelighed af bly fra jordprøverne i de forskellige organismer, og det blev konkluderet, at der endnu ikke er et tilstrækkeligt datamateriale til rådighed til at vise sammenhængen imellem biotilgængelighed i de forskellige organismer /21/. Biotilgængeligheden i samme forsøgsdyr varierer afhængig af målepunktet (f.eks.: knogler, lever, nyrer eller blod), ligesom relevansen af målepunktet varierer med forureningsstoffet (f.eks.: blod er mest relevant for bly, mens nyre er mest relevant for cadmium). Forskellen på in vivo biotilgængelighed i forskellige målepunkter er vist i tabel 2.5 for bly fra forurenet jord. For bly anvendes som standard en beregning af en samlet, vægtet relativ biotilgængelighed, hvor blod indgår med vægten 3 og hver af de øvrige målepunkter med vægten 1 /13/. Tabel 2.5 Relativ biotilgængelighed i forskellige målepunkter fundet ved in vivo (rotter og svin) undersøgelser af bly fra forurenet jord /5//15/
Der er generelt fundet en lineær sammenhæng imellem dosis af bly og indhold af bly i målepunkterne nyrer, lever og knogler, mens der for målepunktet blod ses et faldende optag med stigende dosis, se figur 2.1, /13;15/. Optaget i blod beskrives normalt med en eksponentiel funktion: Cb = k1 + k2 * (1 - e(-k3 * Cd)) , hvor k1, k2 og k3 er konstanter, Cb er blodkoncentrationen i f.eks. µg Pb/L blod, og Cd er den tildelte dosis i f.eks. mg Pb/kg legemsvægt (lv)/dag. Den lineære sammenhæng imellem dosis af bly og optag i organer sammenholdt med den non-lineære sammenhæng for blod peger på, at denne non-linearitet skyldes andre processer end optag af bly fra mave-tarmsystemet /22/. I figur 2.1 er vist et eksempel på en kurve for optag af bly i rotters blod fra forurenet jord og fra en referencedosering af letopløseligt blysalt. Figuren viser, at den absolutte bioopløselighed kan afhænge af dosis, og der er fundet en faldende biotilgængelighed af bly med stigende dosis fra både forurenet jord og referenceopløsning /23/. For at tage højde for, at biotilgængeligheden kan afhænge af dosis, er foreslået at beregne den relative biotilgængelighed som forholdet imellem den maksimale blodkoncentration (”plateaukoncentrationen”) for jord og for referencen, svarende til k2 værdierne i den eksponentielle beskrivelse af blys optag i blod vist ovenfor. Som et eksempel på effekten af forskellig beregning kan nævnes, at den relative biotilgængelighed af bly i jord fra Joplin var 0.44 beregnet ved en blodkoncentration på 60 µg Pb/L, 0.32 ved en blodkoncentration på 100 µg Pb/L og 0.34 beregnet udfra plateaukoncentrationerne /15/. Figur 2.1 Eksempel på en kurve baseret på optag af bly i rotters blod fra forurenet jord og fra en referencedosering af letopløseligt blysalt, efter /15/
Samlet må det vurderes, at der kan være en betydelig variabilitet i in vivo relative biotilgængelighedsdata alene udfra brug af forskellige forsøgsdyr, forskellige målepunkter og forskellige doseringer. Samme variabilitet må forventes at ligge under de toksikologiske og epidemiologiske undersøgelser, der ligger bag højst tilladelige koncentrationer i forurenet jord. En yderligere variabilitet for in vivo data er knyttet til valget af forskellig beregningsmetode. 2.3 Sammenhæng in vitro – in vivo, blySammenhængen imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed er vist for bly i figur 2.2 og figur 2.3 baseret på tidligere offentliggjorte data, se tabel 2.1 og tabel 2.3 for forklaring af benyttede forkortelser og metoder. De offentliggjorte data viser, at:
Det skal bemærkes, at IVG testens tarm segment er udført efter et mave segment i modsætning til de øvrige tests, der omfatter summen af et mave segment og et tarm segment. Derfor giver med tarm segment (IVG I) væsentligt lavere forhold bioopløselighed/biotilgængelighed. Figur 2.2 Sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed for metoder med kun mave segment og in vivo biotilgængelighed af bly fra jord baseret på tidligere offentliggjorte data /2;3;5;15/ Figur 2.3 Sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed for metoder med tarm segment og in vivo biotilgængelighed af bly fra jord baseret på tidligere offentliggjorte data /2;5;14;15/ Dårlig in vitro til in vivo sammenhæng er endvidere fundet for en jord med certificeret indhold af metaller (NIST 2710) i en undersøgelse med MB bioopløselighedsmetoden og biotilgængelighed fundet hos rotter /7/. Tabel 2.6 viser, at in vitro testmetoder som RIVM og TIM i en anden tidligere udført undersøgelse /11/ kunne give bioopløselighed svarende til eller højre end biotilgængelighed målt i mennesker for én jord, mens de øvrige metoder viste betydelige afvigelser imellem in vitro og in vivo. Tabel 2.6 In vitro bioopløselighed af bly for jord fra Bunker Hill sammenholdt med in vivo biotilgængelighed målt i mennesker /11/
Samlet viser de offentliggjorte undersøgelser, at der er fundet en klar sammenhæng imellem blys in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed fra jord, men at forholdet varierer mellem forskellige metoder til in vitro test og in vivo undersøgelser. In vitro test med PBET, SBRC eller RIVM testmetoder, samt in vivo undersøgelser med EPA/svin synes at give de højeste værdier for henholdsvis bioopløselighed og biotilgængelighed. 2.4 Sammenhæng in vitro – in vivo, cadmiumSammenhængen imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed er vist for cadmium i figur 2.4 baseret på tidligere offentliggjorte data. Resultater af test er opdelt efter test med mave segment (til venstre) og test med både mave- og tarm segment. (til højre). In vivo biotilgængelighedsdata stammer fra forsøg med svin efter én metode, og in vitro data stammer fra én test i udformning svarende til fastende forhold. Figur 2.4 Sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed af cadmium fra jord baseret på tidligere offentliggjorte data /6/ for test med kun mave segment (venstre) og med tarm segment (højre) IVG metoden med mave segment viser et mere konstant forhold bioopløselighed/biotilgængelighed (mere lineær sammenhæng) end IVG metoden med tarm segment efter mave segment. Desuden var in vitro test data efter IVG metoden med mave segment overvejende højere end in vivo data, mens dette ikke var tilfældet efter IVG metoden med tarm segment. Igen skal bemærkes, at IVG testens tarm segment er udført efter mave segment i modsætning til andre tests, der omfatter summen af et mave segment og et tarm segment. Derfor giver IVG lave forhold imellem bioopløselighed og biotilgængelighed efter tarm segment. Der foreligger desuden et sæt samhørende data for in vitro bioopløselighed efter DIN test metoden og in vivo biotilgængelighed efter undersøgelsesmetoden med UWBA/svin /14/, men disse data kan ikke sammenlignes, da den relative biotilgængelighed ikke kan beregnes på grund af undersøgelsens udformning (doseringsreference ikke medtaget). Samlet viser de offentliggjorte undersøgelser, at der i en enkelt undersøgelse er fundet en klar sammenhæng imellem cadmiums in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed fra jord, men at forholdet varierer for forskellige segmenter i in vitro test metoden. In vitro test med IVG testmetoden med mave segment giver højere værdier for cadmium bioopløselighed end in vivo undersøgelser med EPA/svin og metoden må altså betragtes som konservativ. 2.5 Sammenhæng in vitro – in vivo, nikkelDer er fundet ét sæt samhørende data for in vitro bioopløselighed af nikkel fra jord efter DIN test metoden og in vivo biotilgængelighed efter undersøgelsesmetoden med UWBA/svin /14/, men disse data kan ikke sammenlignes, da den relative biotilgængelighed ikke kan beregnes på grund af undersøgelsens udformning (doseringsreference ikke medtaget). 2.6 Sammenhæng in vitro – in vivo, PAHDer er fundet ét sæt samhørende data for in vitro bioopløselighed af PAH fra jord efter DIN test metoden og in vivo biotilgængelighed efter undersøgelsesmetoden med UWBA/svin beregnet på basis af PAH udskilt med fæces /14/. Kun for benzo(a)pyren er medtaget en doseringsreference, som tillader beregning af relativ biotilgængelighed. Resultaterne er vist i figur 2.5. Figur 2.5 Sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed af benzo(a)pyren fra jord baseret på tidligere offentliggjorte data /14/
Det begrænsede antal data tillader ikke en vurdering af in vitro til in vivo korrelationen, og der skal erindres om, at den her benyttede in vivo metode giver en overvurdering af de organiske stoffers biotilgængelighed, fordi den er baseret på udskilt restmængde med fæces, se afsnit 2.2. Det er i en tidligere analyse /1/ af data fra denne undersøgelse /14/ vist, at selvom der ikke er lineær sammenhæng imellem in vivo biotilgængelighed (ikke udskilt med fæces) og in vitro bioopløselighed for alle undersøgelsens PAH fra alle jordprøver, så er der god sammenhæng for alle PAH fra én af jordprøverne, samt for 4 udvalgte PAH fra alle jordprøverne. For pyren kan biotilgængeligheden opgøres udfra mængde udskilt med fæces og udfra mængde udskilt som 1-hydroxypyren med urin i in vivo undersøgelser med henblik på sammenligning med bioopløselighed målt ved in vitro test /14/. I tabel 2.7 er på denne måde vist biotilgængelighed og bioopløselighed for 4 undersøgte jorde, normeret i forhold til den jord, der viste højeste biotilgængelighed og bioopløselighed. Tabel 2.7 Biotilgængelighed og bioopløselighed af pyren fra jorde, normeret i forhold til den jord, der viste højeste biotilgængelighed og bioopløselighed, data fra /14/
De relative udtryk for pyrens biotilgængelighed og bioopløselighed viser ikke samme billede, ligesom der ikke kan ses en sammenhæng imellem rækkefølgen for pyren og benzo(a)pyren (BaP). Det skal bemærkes, at udskillelse af 1-hydroxypyren med urinen varierede op til over 100% imellem de fire svin i én forsøgsgruppe doseret med samme jord. For én gruppe så man endvidere bort fra resultaterne fra ét dyr af fire pga. stor variation. Samlet er der ikke offentliggjort undersøgelser, der hverken kan vise eller afvise sammenhæng imellem in vivo biotilgængelighed og in vitro bioopløselighed af PAH. 2.7 Sammenhæng in vitro – in vivo genereltI forbindelse med sammenligninger af in vitro og in vivo værdier for henholdsvis bioopløselighed og biotilgængelighed skal gøres opmærksom på en række begrænsninger for sådanne sammenligninger:
Derfor bør sammenhænge alene vurderes opdelt i sammenlignelige metoder, og hverken in vitro eller in vivo resultater kan a priori betragtes som ”sande”.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
