| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Test for human bioopløselighed af jordforureninger

9 Vurdering og anbefalinger

• 9.1 In vivo og in vitro metoder
• 9.2 Doseringsreference
• 9.3 Valg af tests og testbetingelser
• 9.4 Afprøvning af RIVM testmetoder
• 9.5 Test af jord for forurenede danske grunde med RIVM metoderne
• 9.6 RIVM test af prøver med in vivo målt biotilgængelighed
• 9.7 Test med andre metoder af prøver med in vivo målt biotilgængelighed
• 9.8 Anvendelse af test for bioopløselighed i risikovurdering

De danske jordkvalitetskriterier (2005) for metallerne bly (Pb) og nikkel (Ni), samt de polycyckliske aromatiske kulbrinter (PAH forbindelserne) benzo(a)pyren (BaP) og dibenzo(a,h)anthracen (DbahA) er helt eller delvist baserede på risikoen ved oralt optag i mennesker. Det samme gælder afskæringskriteriet for cadmium (Cd). En gennemgang af den videnskabelige og tekniske litteratur samt konsultationer med internationalt førende forskere på området har tidligere vist, at i nogen tilfælde er kun en del af jordens totale indhold af forureninger tilgængelig for optag i menneskets mave-tarmsystem /24/. Tilsvarende er det velkendt, at jordforureningers biotilgængelighed for og toksicitet overfor mikroorganismer, planter og dyr varierer /73-76/.

9.1 In vivo og in vitro metoder

Måling af en jordforurenings optag med direkte relevans for vurdering af risiko ved humant, oralt optag foretages optimalt ved forsøg med dyr (eller mennesker): in vivo undersøgelse af forureningens biotilgængelighed. Der benyttes en række forskellige in vivo metoder til at måle stoffers orale biotilgængelighed (se f.eks. oversigten i /1/), men i praksis er primært anvendt, dokumenteret og anerkendt en metode med måling af optag af bly i unge svin, som er udviklet for den amerikanske Miljøstyrelse (US EPA). Metoden er også benyttet for cadmium, og bør i princippet på tilsvarende vis kunne benyttes for nikkel. For PAH findes ikke en dokumenteret og anerkendt metode til måling af biotilgængelighed, først og fremmest på grund af PAHs nedbrydning og omdannelse i forsøgsdyrene.

In vivo metoder til måling af jordforureningers biotilgængelighed er behæftede med betydelig variabilitet og resultaterne afhænger af forsøgsdyr, målepunkter (blod, organer), doseringer og beregningsmåde. Anvendes samme forsøgsdyr, målepunkter og doseringer, er f.eks. fundet en variabilitet (relativ standardafvigelse) på 8-53% for in vivo relativ biotilgængelighed af bly fra 6 forurenede jorde /14/. Det må forventes, at samme variabilitet vil findes for dyreforsøg til fastlæggelse af toksicitet af forureninger.

Fordi in vivo undersøgelser er omkostningstunge, tidskrævende og etisk ikke uproblematiske, benyttes i stedet måling af den fraktion af en jordforurening, der kan opløses i menneskets mave-tarmsystem som et mål for stoffernes højest mulige orale biotilgængelighed: in vitro test for den humane bioopløselighed. Bioopløseligheden af jordforureninger afhænger af forureningers kemiske egenskaber, jordtype og –egenskaber og forholdene i mave-tarmsystemet.

Der benyttes en række forskellige in vitro metoder til at måle stoffers bioopløselighed i det humane mave-tarm system, se f.eks. oversigten i /1/. Metoderne er primært anvendt til måling af bioopløselighed af bly og cadmium fra jord, men også i enkelte tilfælde for nikkel og PAH.

In vitro metoderne er ligeledes behæftede med betydelig variabilitet, og resultaterne afhænger af test betingelser (primært pH) og segmenter (mave, tarm) medtaget. Anvendes samme metode, er f.eks. fundet en variabilitet (relativ standardafvigelse) på 0.2-7% for in vitro relativ bioopløselighed af bly fra de samme 6 forurenede jorde /14/, som er nævnt ovenfor, altså betydeligt mindre end for in vivo biotilgængelighedsresultaterne.

Valget af in vitro metoder til bestemmelse af jordforureningers bioopløselighed med henblik på brug i risikovurdering baseres på ønsket om, at testmetoderne skal være:

• forklarlige (dvs. simulere opløsningsprocesserne i menneskets mave-tarmsystem)
• robuste (dvs. kunne gentages med ”samme” resultat)
• relevante (dvs. give resultater svarende til resultaterne af optagsforsøg i dyr eller mennesker)

Ingen test metoder opfylder de angivne ønsker fuldstændigt, men en række metoder opfylder de vigtigste af ønskerne eller kan bringes dertil relativt simpelt: PBET (flere versioner, fysiologisk baseret), RIVM (fastende og efter måltid versioner, fysiologiske betingelser tilstræbt) og DIN (fysiologiske betingelser tilstræbt). Dertil kommer den simple SBRC test, som anvendes udbredt i USA uden at være fysiologisk baseret.

Der foreligger på nuværende tidspunkt ikke rapporter om egentlige metodeafprøvninger med flere laboratoriers deltagelse med samme testmetode, ligesom der ikke foreligger rapporter om præstationsprøvninger for bioopløselighed af jordforureninger. Da litteraturen om testmetoder for bioopløselighed tillige først og fremmest er rettet imod udvikling af metoder og kobling til biotilgængelighedsdata (se nedenfor), kan metodernes generelle robusthed ikke vurderes endnu. Det skal dog bemærkes, at test for bioopløselighed er metodeafhængig (sammenlign f.eks. med analyse for biokemisk iltforbrug, BOD5 af spildevand, der ligeledes er metodeafhængig, men benyttes udbredt), og forskellige metoder vil derfor ikke automatisk give samme resultat. Det er derfor afgørende nødvendigt for retvisende brug af bioopløselighed i risikovurdering af forurenet jord, at der vælges én eller nogle få test metoder.

For bly og cadmium er i tidligere undersøgelser fundet god sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed. Sammenhængen afhænger både af in vitro metode og in vivo metode og er specielt for bly bedst for metoder med kun et mave segment. For nikkel og PAH er ikke fundet tilstrækkeligt datamateriale til at foretage en endelig vurdering.

Det skal bemærkes, at en god sammenhæng in vitro til in vivo ikke i sig selv er et tilstrækkeligt kriterium for en testmetode for bioopløselighed af jordforureninger, der er velegnet til brug i risikovurdering. Testmetoden skal dels tillige være forklarlig og robust, som beskrevet ovenfor, dels er in vivo metoder som nævnt fejlbehæftede på samme måde som andre undersøgelsesmetoder, se afsnit 2.7.

9.2 Doseringsreference

Grænserne for jords indhold af forureninger er oftest sat udfra giftighed overfor dyr eller optag i mennesker fundet med forureninger tilført i ren form (den toksikologiske reference) og dermed uden begrænsninger i tilgængelighed. Derfor er der behov for at inddrage jordforureningers tilgængelighed ved formulering og/eller håndhævelse af grænseværdier baseret på risiko ved oralt optag.

Formålet med test for human bioopløselighed er at måle forskellen i opløselighed af en jordforurening relativt til opløseligheden af det samme stof i den toksikologiske reference. Med henblik på at give et relativt mål for jordforureningernes bioopløselighed, sammenholdt med bioopløseligheden af stofferne i de biologiske undersøgelser, som ligger bag kriterierne, er identificeret de doseringsformer, som er benyttet her, se kapitel 3. For Pb og Ni er på den baggrund i denne undersøgelse benyttet opløsning af letopløselige salte i vand som toksikologisk reference, mens der for Cd (vandig opløsning af letopløseligt salt) og PAH (opløsning i organisk opløsningsmiddel) er benyttet tilsætning til hvedemel svarende til dosering med føde i de toksikologiske undersøgelser. Da der hverken for Cd eller PAH er fundet væsentlig forskel på genfindingen fra vandig/organisk opløsning og fra hvedemel (se kapitel 5), anbefales i fremtiden kun at benytte opløsninger i vandig/organisk opløsning som doseringsreferencer.

9.3 Valg af tests og testbetingelser

I kapitel 4 er opsummeret testtekniske krav for in vitro metoder med henblik på anvendelse i risikovurdering for jordforureninger. Der er med udgangspunkt i disse krav og i den ovennævnte rapport /24/ i første omgang valgt at afprøve testmetoderne RIVM fastende og efter måltid med henblik på bioopløselighed af de udvalgte jordforureninger, metallerne Cd, Ni og Pb, henholdsvis PAH forbindelserne BaP og DBahA. Begge RIVM metoderne omfatter de 3 segmenter: mund/spiserør, mave og tarm og tilstræber at simulere fysiologiske forhold i menneskets mave-tarmsystem.

RIVM fastende metoden simulerer forholdene i et fastende barns mave og er valgt som test metode for metallers bioopløselighed. Denne test anføres i litteraturen at give et realistisk, men forsigtigt mål for metallers bioopløselighed, særligt fordi metoden anvender en lav pH ved simulering af opløsning i mavesækken og en relativt lav pH ved simulering af opløsning i tyndtarmen. For de organiske PAH forureninger er valgt en anden version af samme test, RIVM efter måltid, der simulerer forholdene i barnets mave efter indtagelse af et måltid. Denne test anføres i litteraturen at give et realistisk, men forsigtigt mål for opløsningen af apolære organiske forureninger som PAH, fordi metoden anvender noget højere pH i alle trin, øget tilsætning af galde, samt tilsætning af fødesurrogat. Afprøvningen af testene viste tillige, at kolloidt bundne metaller og PAH i testresultaterne medtages som bioopløselige.

På grund af utilfredsstillende sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed for bly fra en række jordprøver med in vivo data opnået i andre undersøgelser valgtes at foretage en supplerende vurdering af to alternative test metoder for bioopløselighed af bly og cadmium fra jord: RIVM fastende uden tarm segment og SBRC.

9.4 Afprøvning af RIVM testmetoder

Afprøvningen af RIVM testmetoderne viste, at testen for metaller kan benyttes med detektionsgrænser under 1/10 af kriterieværdierne med præcision svarende til kvalitetsklasse 3, eller for bly af forsøgstekniske årsager noget dårligere, lineært til 4–5 x kriterieværdien (kapitel 5). Kravet til genfinding af tilsatte mængder metal i testen kan ikke afprøves, men bioopløseligheden fundet i denne afprøvning for et kontrolmateriale var af samme størrelsesorden som fundet af andre laboratorier med sammenlignelige testmetoder, undtagen for bly. Testen for PAH kan benyttes lineært fra eller under 1/10 af kriterieværdierne til 500 x kriterieværdierne. Præcisionen er noget dårligere end gældende for kvalitetsklasse 3, men dette er forventeligt for en analyse for organiske stoffer i jord (kapitel 5).

Testkvaliteten skal kontrolleres i hver testserie med mindst 2 blindprøver og 2 syntetiske kontrolprøver (benyttes også som doseringsreferencer), 1 dobbeltbestemmelse per lokalitet, samt 1 stabil og homogen kontrolprøve.

For de analysemetoder, der benyttes til analyse af testopløsningerne og jord, gælder, at der skal stilles krav til dokumentation af overholdelse af specificerede krav til præcision, genfinding og detektionsgrænse, hvis den krævede testkvalitet skal kunne overholdes. Endvidere skal for jord benyttes samme metoder, som benyttes ved analyse af totalkoncentrationer til kontrol af kvalitetskriterier. Analysekvaliteten skal dokumenteres ved validering af de benyttede metoder inden test, samt ved løbende kvalitetskontrol ifølge de metoder og anvisninger, der normalt benyttes for analysemetoder. Realistiske krav til test- og analysekvalitet er opsummeret i tabel 4.3, idet det tillige skal gælde, at målte bioopløselige koncentrationer skal være indenfor det dokumenteret lineære område for testene.

Det har vist sig nødvendigt at gennemføre metal analyser af testopløsninger fra RIVM fastende som ”straksanalyser” af ukonserverede men syrefortyndede prøver, samt at foretage en beregning af relativ bioopløselighed, der inkluderer slut pH i tarm segmentet. Endvidere har denne test særligt for bly udvist en ikke tilfredsstillende høj variabilitet med længere tid imellem test serierne og imellem forskellige laboratorier (manglende robusthed).

9.5 Test af jord for forurenede danske grunde med RIVM metoderne

Ved afprøvning af RIVM testene på jordprøver fra 7 danske lokaliteter med forskellige forureningskilder er fundet bioopløselige koncentrationer af forureninger i jordprøverne, der var under eller væsentligt under de totale koncentrationer (tabel 6.9). Variabiliteten af målte bioopløselige koncentrationer var lidt større end, men af samme størrelsesorden som variabiliteten for totalkoncentrationer (tabel 6.7). I tabel 9.1 er givet det spænd, indenfor hvilket man udfra denne begrænsede undersøgelses datamateriale kan anslå, at test for human bioopløselige jordforureninger vil være relevant for fastlæggelsen af den reelle risiko ved oralt optag.

Tabel 9.1 Spænd for relevant anvendelse af test for human bioopløselighed af jordforureninger som opnået med RIVM metoderne for danske jorde

Test af jordprøver fra de danske forurenede grunde med andre test metoder, se kapitel 8, tyder på, at resultaterne opnået med RIVM fastende metoden for bly har givet for lave bioopløseligheder for prøver fra 4 af de 6 grunde i undersøgelsen.

9.6 RIVM test af prøver med in vivo målt biotilgængelighed

Der er i denne undersøgelse foretaget in vitro test af i alt 66 jordprøver med in vivo biotilgængelighedsdata fra tidligere undersøgelser. Heraf er 49 prøver testet med metoden RIVM fastende for metaller og 17 prøver med RIVM metoden efter måltid for PAH, som tidligere beskrevet, se også Bilag A og B for metodebeskrivelser.

For bly er ikke fundet en tilfredsstillende sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed (non-lineær og in vitro resulater lavere end in vivo). Det kan ikke afvises, at fejl i in vivo målinger (dosis afhængighed ved høj bioopløselighed) har medvirket til den ikke tilfredsstillende in vitro til in vivo sammenhæng.

For cadmium er fundet tilfredsstillende sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed (lineær og in vitro resultater af samme størrelsesorden som in vivo).

For nikkel og PAH er ikke fundet tilstrækkeligt mange in vivo data til endeligt at vurdere in vitro til in vivo sammenhængen.

For alle undersøgelsens forureningsstoffer undtagen bly er fundet tilfredsstillende sammenhæng imellem de her benyttede in vitro metoders resultater og andre in vitro metoders resultater (lineær og in vitro resultater af samme størrelsesorden som andre metoders). For bly er fundet en lineær sammenhæng med resultater bestemt ved de fleste andre metoder, men lavere resultater med RIVM metoden i denne undersøgelse. RIVM metoden har dog givet højere in vitro resultater end andre metoder med både mave og tarm segment.

9.7 Test med andre metoder af prøver med in vivo målt biotilgængelighed

De 2 alternative test metoder, RIVM fastende uden tarm segment og SBRC, viste ikke forbedret lineær sammenhæng imellem in vitro resultater og in vivo resultater for cadmium. For bly viste SBRC lineær sammenhæng men med relativt høje in vitro resultater, sammenholdt med in vivo resultaterne. RIVM fastende uden tarm segment viste lineær sammenhæng og mere realistiske in vitro værdier, når resultaterne for test af jordprøver med for høj pH i testopløsningerne blev udelukket. Sikring af pH under testen kan for afvigende prøver indtil videre udføres ved at benytte en reduceret prøvemængde, men der arbejdes på at justere sammensætningen (bufferkapaciteten) af fordøjelsesvæskerne, således at dette på længere sigt ikke bliver nødvendigt. RIVM fastende uden tarm segment viste lineær sammenhæng med andre in vitro testmetoder for cadmium, men ikke for bly (kun det komplette datasæt inklusive pH afvigende prøver kunne vurderes), mens SBRC metoden netop opfyldte kravet til lineær sammenhæng for bly, men ikke for cadmium.

9.8 Anvendelse af test for bioopløselighed i risikovurdering

I tabel 9.2 er sammenfattet den overordnede vurdering af de forskellige, afprøvede testmetoders anvendelighed til måling af de udvalgte jordforureningers bioopløselighed med henblik på anvendelse i risikovurdering på forurenede grunde. Kvantitativt anvendelige metoder er fysiologisk relevante, har udvist tilfredsstillende robusthed og lineær sammenhæng imellem testresultater og in vivo data for de jordprøver, der har været til rådighed for test. Kvalitativt anvendelige metoder er fysiologisk relevante, har udvist tilfredsstillende robusthed, men jordprøver med in vivo data har ikke været til rådighed i tilstrækkeligt omfang til at vurdere in vitro til in vivo sammenhæng. For RIVM fastende uden tarm segment gælder, at metodens anvendelighed forudsætter pH under den krævede værdi på 1.8 i testopløsningen i mave segmentet. Er dette ikke opfyldt, skal testen gentages med mindre mængde (1/10) jord. Det anførte ”forbehold” betyder for SBRC, at denne test ikke er fysiologisk baseret, samt at den opnåede in vitro til in vivo tyder på en overvurdering af blys bioopløselighed fra jordprøver med denne test.

Tabel 9.2 Sammenfatning af anvendeligheden af de afprøvede testmetoder for jordforureningers bioopløselighed

Det vurderes dermed, at test for bioopløselighed kan udføres kvantitativt med RIVM fastende uden tarm segment for bly og med RIVM fastende for cadmium. Det skal bemærkes, at den samlede test for bioopløselighed af bly og cadmium dermed kan udføres i én samlet procedure, blot med udtag af testopløsning til kemisk analyse på forskelligt trin i testen. Det skal endvidere bemærkes, at der internationalt i regi af BARGE arbejdes med en justering af RIVM test metoden til at opfylde det anførte pH krav for et bredere udsnit af prøver, samt efterfølgende at dokumentere kvaliteten af den justerede test metode.

Det vurderes desuden, at test for bioopløselighed kun kan udføres kvalitativt for nikkel og PAH, indtil til flere jordprøver med in vivo data for biotilgængelighed foreligger. Bioopløseligheden af PAH i en jordprøve kan således indtil videre kun tolkes relativt, dvs. til at sige at PAH i en testet jordprøve er mere eller mindre biotilgængelig end i en anden jordprøve eller i en toksikologisk reference, men dokumentationen er ikke tilstrækkelig til at tillade en beregning af en bioopløselig koncentration til at holde op imod en kriterieværdi.

Selve bioopløseligheden, AF, beregnes som forholdet imellem mængde af stof opløst under en test, M_t, og mængden i jorden, M_j, eller doseringsreferencen, M_r, vist for beregning i en jordprøve:

AF_j = M_t / M_j

Den relative bioopløselighed, RAF, beregnes udfra bioopløseligheden af forureningen i jorden, AF_j, og bioopløseligheden af forureningen i doseringsreferencen, AF_r:

RAF = AF_j / AF_r

De målte totalkoncentrationer, C_j, og relative bioopløseligheder (RAF) benyttes til at beregne jordens indhold af bioopløselig forurening, C_bo, efter formlen:

C_bo = C_j × RAF

På denne måde beregnes en forurenings koncentration af bioopløselig forurening baseret på den relative bioopløselighed fra jorden.

Det foreslås, at bioopløselige koncentrationer benyttes på samme måde i forhold til kriterieværdier, som totalkoncentrationer benyttes i dag, fordi størrelsesordenen af usikkerheden er den samme ved de to bestemmelser.

Det vurderes, at det nu opnåede datamateriale udviser så stor variation i den relative bioopløselighed for de undersøgte forureninger, at en generel justering af kriterieværdierne ikke kan underbygges. Det anbefales derfor indtil videre at fastholde en test af jord fra den enkelte forurenede lokalitet som forudsætning for anvendelse af human bioopløselighed til vurdering i forhold til kriterieværdier. For undersøgelser på forurenede grunde benyttes i dag at sammenholde gennemsnittet af jordkoncentrationer med kriteriet for forureninger med kroniske effekter, kombineret med et krav til frekvens af overskridelser og maksimal overskridelse for forureninger med akutte effekter.

Anvendelsen af test for bioopløselighed bør understøttes på 3 konkrete punkter:

• En konkret vejledning i anvendelsen af test for bioopløselighed i risikovurdering på forurenede grunde udarbejdes med udgangspunkt i dette projekts resultater og omfattende mindst forudsætninger for testanvendelse, metodeanvisning, beregninger, nødvendigt antal testede prøver og kvalitetskontrol af tests
• Anvisning af et homogent og stabilt kontrolmateriale, der skal benyttes i kvalitetskontrol af tests
• Opsamling og vurdering af testdata og kontroldata efter 1 års anvendelse

De enkelte punkters indhold er opridset nedenfor.

I en vejledning bør indgå, at der med henblik på at sikre et tilstrækkeligt grundlag for beregning af den bioopløselige koncentration indtil videre mindst bør foretages test af 5 jordprøver fra hver grund eller klynge af grunde, svarende til prøvetagningen benyttet i denne afprøvning. For disse jordprøver bør den bioopløselige koncentration af forureningerne i hver enkelt jordprøve, Cbo, beregnes og benyttes til vurdering i forhold til kriterieværdien. Stilles der krav om analyse af flere jordprøver, kan den gennemsnitlige, relative bioopløselighed fra test af de 5 jordprøver benyttes til at omregne fra total koncentration til bioopløselig koncentration for de øvrige prøver, forudsat at forureningens karakter ikke varierer indenfor undersøgelsesområdet. I forbindelse med anvendelsen af testene foreslås det at tilvejebringe et tilstrækkeligt datamateriale til at definere, hvornår ”forureningens karakter ikke varierer indenfor undersøgelsesområdet”.

For at give mulighed for løbende kvalitetssikring og sammenlignelig anvendelse af testene på danske laboratorier foreslås at identificere et stabilt og homogent kontrolmateriale. Ved indkøb af et stabilt og homogent kontrolmateriale i stor mængde vil danske laboratorier som nævnt dels kunne medtage dette under test for at sikre sammenlignelige resultater, dels vil materialet kunne deles med internationale laboratorier, således at der kan etableres sammenlignelighed med disses testresultater og evt. kobling til resultaterne af biotilgængelighedsundersøgelser med forurenet jord i dyr.

Det foreslås tillige, at testresultater opnået i Danmark over den første periode opsamles og vurderes samlet, således at muligheden for implementering af generelle faktorer for bioopløselighed af udvalgte jordforureninger kan vurderes udfra et mere omfattende datagrundlag. I den forbindelse kan ligeledes foretages en vurdering af variationen i bioopløselighed på grunde med varierende forureningskilde. Ligesom det kan afgrænses for hvilke typer af grunde og for hvilke forureninger, test for bioopløselighed vil forbedre grundlaget for risikovurderingen.

Opmærksomheden henledes på, at der er behov for forbedrede og bedre afprøvede metoder til in vivo undersøgelse af jordforureningers biotilgængelighed. Endvidere henledes opmærksomheden på, at for forureninger med en risiko ved hudkontakt kan denne blive betydende i den samlede risikovurdering, såfremt en meget lav, målt bioopløselighed lægges til grund for vurderingen af risiko ved oralt optag. Endeligt skal bemærkes, at grundlaget for dette projekt har været kvalitets- og afskæringskriterierne, som de forelå inden implementering af Kriteriegruppens arbejde, se afsnit 3.1.

Samlet vurderes det, at den i øjeblikket bedst mulige test- og analysekvalitet er opnået, og at dette er tilstrækkeligt til anvendelsen af testmetoderne som beskrevet, kvantitativt for bly og cadmium, kvalitativt for nikkel og PAH. Det skal bemærkes, at testene ikke er afprøvede overfor flygtige stoffer (nogle kviksølvforbindelser og organiske stoffer), og ikke overfor stoffer, der påvirkes af mikroorganismerne i mave-tarmsystemet (potentielt krom- og arsenforbindelser, letnedbrydelige organiske stoffer).

Fodnoter

[26] For bly er spændet formodentlig overvurderet med RIVM fastende test metoden, se teksten, korrekt spænd er formodentlig 1-2 for de danske jordprøver, der er test her

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Maj 2006, © Miljøstyrelsen.