|
Test for human bioopløselighed af jordforureninger 8 Test af prøver med in vivo biotilgængelighed efter andre metoder
To andre test metoder, RIVM fastende uden tarm segment og SBRC, blev i undersøgelsens fase 3 afprøvet med henblik på at identificere metoder med en mere tilfredsstillende sammenhæng in vitro til in vivo end RIVM fastende metoden til test af blys bioopløselighed fra indhentede jordprøver, se afsnit 7.3.1. RIVM test metoden uden tarm segment blev udvalgt til denne afprøvning af andre metoder, fordi forhøjet pH i tarm segmentet af RIVM fastende tidligere var identificeret som én årsag til dårlig sammenhæng imellem in vitro og in vivo resultater, se afsnit 5.3 og 7.3.1. SBRC metoden /64/ som offentliggjort af John Drexler /4/ blev udvalgt, fordi den er udviklet med henblik på at være en robust metode med kun et surt mave segment, fordi acceptable in vitro til in vivo sammenhænge er offentliggjort for bly med metoden /4;64/, og fordi metoden svarer til de krav, som den amerikanske miljøstyrelse (US EPA) forventes at opstille for en bioopløselighedstest til brug i risikovurdering af forurenet jord. Til afprøvningen udvalgtes 26 jordprøver med bly og/eller cadmium biotilgængelighed undersøgt in vivo i EPA/svin, samt 1 jordprøve undersøgt i UWBA/svin. Derudover blev medtaget 6 jordprøver fra danske forurenede grunde, der var blevet testet tidligere efter RIVM fastende metoden. For at vurdere, om de benyttede danske jordprøver havde ændret sig som følge af opbevaring fra fase1/2 til fase 3 blev de 6 danske jordprøver genanalyseret for metallerne bly og cadmium i fase 3. Resultaterne i tabel 8.1 viser at jordprøver i fase 3 udviser nogenlunde samme homogenitet (udtrykt som den relative standardafvigelse/spredning for indhold af bly og cadmium) som tidligere fundet ved dobbelt test af jordprøverne (bly 14% og cadmium 12% relative standardafvigelse, se tabel 6.8), ligesom der ikke var nogen klar forskel på indholdet af bly fundet i fase 1 og fase 3. For cadmium var analyseresultatet i fase 3 gennemsnitlig 21% under resultatet i fase 1. For de hjemhentede prøver sås generelt lavere resultater af jordanalyser i fase 3 end i fase 2 for både bly og cadmium, se tabel 7.2. Tabel 8.1 Homogenitet og metal indhold i danske jordprøver i fase 1 og 3
Analyse i fase 3 af det certificerede referencemateriale NIST 2711 for cadmium gav et resultat omkring 20% under det forventede, men for bly et resultat svarende til det forventelige, se tabel 4.5. På den baggrund er det valgt i fase 3 at benytte resultater af jordanalyser for bly som fundet i denne fase, men at forkaste resultaterne af jordanalyser for cadmium. I stedet er resultaterne fra tidligere faser for samme jordprøver benyttet. 8.1 Test af hjemhentede prøver med RIVM fastende uden tarm segmentRIVM fastende blev gennemført som beskrevet /8/, se også afsnit 2.1 og Bilag A for beskrivelse af metoden, men uden at gennemføre testens trin med tarm segment. Testen blev dog afprøvet med reduceret jordmængde (0.3 g imod foreskrevet 0.6 g) på grund af de små mængder af jordprøver til rådighed, men testens oprindelige, samlede væske til fast stof forhold (liquid to solid ratio, L/S) på 22.5 for mund/spiserør og mave segment blev opretholdt ved ligeledes at benytte mindre tilsætninger af fordøjelsesvæskerne. Relativ bioopløselighed er i denne fase beregnet udfra målt bioopløselighed af referenceprøver. Der er udført test på 2 delprøver af 10 prøver, samt på 5 delprøver af 1 prøve, og udfra dobbeltbestemmelser og replikater er den relative standardafvigelse beregnet (se /62/ for beskrivelse af metoden) for både prøveinhomogenitet og analytisk/test præcision (repeterbarhed). Testmetoden har netop overholdt kravet til en samlet test præcision bedre end 15% for både bly og cadmium, men præcision er klart dårligst for bly, tabel 8.2. Tabel 8.2 Relativ standardafvigelse for dobbelttest og replikat test af in vitro bioopløselighed i et udsnit af prøver, RIVM fastende uden tarm segment
8.1.1 BlyI alt 18 prøver med in vivo biotilgængelighed målt i EPA/svin blev test efter RIVM fastende uden tarm segment, figur 8.1. Der var ikke lineær sammenhæng imellem in vitro og in vivo data. For 6 af de testede prøver var pH efter mave segmentet over den anbefalede værdi på 1.8, se afsnit 5.3. Medtages kun de resterende 12 prøver med pH værdi i testens mave segment under den anbefalede værdi på 1.8, opnåedes en lineær sammenhæng med in vivo data, figur 8.2. Den gode lineære sammenhæng in vitro til in vivo, når prøver med for høj test pH udelukkes, figur 8.2, peger på, at en tilfredsstillende sammenhæng kunne opnås for alle prøver, såfremt pH i mave segmentet kunne holdes som anbefalet på under 1.8. En del af de her testede jorde er tidligere testet for blys bioopløselighed efter andre metoder (IVG /5/, DIN /14/, SBRC /22/), men der var ikke lineær sammenhæng imellem disse data og data opnået med RIVM fastende uden tarm segment metoden. Der var ikke tilstrækkeligt mange data med både pH < 1.8 og test resultater til rådighed opnået med andre metoder til at tillade en analyse af den lineære sammenhæng. Figur 8.1 In vitro bioopløselighed af bly efter RIVM fastende uden tarm segment imod in vivo biotilgængelighed fundet i EPA/svin
Figur 8.2 In vitro bioopløselighed af bly efter RIVM fastende uden tarm segment imod in vivo biotilgængelighed fundet i EPA/svin, pH efter mave segment <1.8
Denne test metode er ikke benyttet i andre faser af denne undersøgelse, hvorfor variationen imellem test serier ikke kan belyses. 8.1.2 CadmiumI alt 13 prøver med in vivo biotilgængelighed målt i EPA/svin blev test efter RIVM fastende uden tarm segment, figur 8.3. Der var lineær sammenhæng imellem in vitro og in vivo data, og in vitro data var generelt noget højere end in vivo data. En del af de her testede jorde er tidligere testet for cadmiums bioopløselighed efter en anden metode (IVG G /6/), men resultaterne opnået med de 2 metoder udviser netop ikke lineær sammenhæng, figur 8.4. Figur 8.3 In vitro bioopløselighed af cadmium efter RIVM fastende uden tarm segment imod in vivo biotilgængelighed fundet i EPA/svin
Figur 8.4 In vitro bioopløselighed af cadmium opnået med en anden metode (IVG /6/) afbildet imod bioopløselighed opnået med RIVM fastende uden tarm segment
IVG G metoden giver højest bioopløselighed for lave værdier, mens RIVM fastende uden tarm segment giver højest bioopløselighed for høje værdier. Denne test metode er ikke benyttet i andre faser af denne undersøgelse, hvorfor variationen imellem test serier ikke kan belyses. 8.2 Test af hjemhentede prøver med SBRCSBRC metoden blev gennemført som beskrevet /4/, se også afsnit 2.1 og Bilag C for beskrivelser af metoden, men testen blev dog afprøvet med reduceret jordmængde (0.5 g imod foreskrevet 1.0 g) på grund af de små mængder af jordprøver til rådighed. Testens oprindelige væske til fast stof forhold (liquid to solid ratio, L/S) på 100 blev opretholdt ved at benytte mindre tilsætninger af fordøjelsesvæskerne. Relativ bioopløselighed er i denne fase beregnet udfra målt bioopløselighed af referenceprøver. Inden test af jordprøver blev indkøbt filtre af den type, der angives i testforskriften /4/, og såvel filtre som procedure blev gennemført med henblik på sikring af tilstrækkeligt lave blindresultater (blindprøver) og tilstrækkeligt god genfinding af metaller tilsat som en opløsning af metalsalte (syntetiske kontrolprøver). Der var ikke tegn på prøveforurening med eller -tab af bly og cadmium i test proceduren, tabel 8.3. Tabel 8.3 Kontrol af blindbidrag og genfinding af kontrol i SBRC test
Der er udført test på 2 delprøver af 10 prøver, samt på 4 delprøver af 1 prøve og udfra dobbeltbestemmelser og replikater er den relative standardafvigelse beregnet (se /62/ for beskrivelse af metoden) for både prøveinhomogenitet og analytisk/test præcision (repeterbarhed). Testmetoden har overholdt kravet til en samlet test præcision bedre end 15% for både bly og cadmium, men præcision er dårligst for bly, tabel 8.4. Tabel 8.4 Relativ standardafvigelse for dobbelttest og replikat test af in vitro bioopløselighed i et udsnit af prøver, SBRC
8.2.1 BlyI alt 18 prøver med in vivo biotilgængelighed målt i EPA/svin blev test efter SBRC metoden, figur 8.5. Der var lineær sammenhæng imellem in vitro og in vivo data, og generelt var in vitro bioopløseligheder højere end in vivo biotilgængeligheder. En del af de her testede jorde er tidligere testet for blys bioopløselighed efter andre metoder (IVG G /5/, DIN /14/) eller med samme metode i andre studier (SBRC /22/). Der var netop lineær sammenhæng imellem data opnået med SBRC metoden i denne undersøgelse og i andre studier, figur 8.6, med data fra denne undersøgelse generelt højere end tidligere rapporteret for samme jorde med samme metode /22/. Der var ikke lineær sammenhæng imellem data opnået med SBRVC og med IVG G, som kun omfatter et mave segment, og for DIN metoden var der ikke tilstrækkeligt mange data til at muliggøre en vurdering af en eventuel lineær sammenhæng. Figur 8.5 In vitro bioopløselighed af bly efter SBRC imod in vivo biotilgængelighed fundet i EPA/svin
Figur 8.6 In vitro bioopløselighed af bly opnået med andre metoder (IVG /5/, DIN /14/) eller med samme metode i andre studier (SBRC /22/) afbildet imod bioopløselighed opnået med SBRC i denne undersøgelse
For SBRC metoden er tidligere specificeret, at det certificerede referencemateriale NIST 2711 skal anvendes til intern kvalitetskontrol, hvor resultatet skal være indenfor 9.22±1.50 mg bly/L testopløsning. I denne undersøgelse blev fundet 9.7 mg/L ved dobbelt test af NIST 2711, hvilket er indenfor det foreskrevne interval. Denne test metode er ikke benyttet i andre faser af denne undersøgelse, hvorfor variationen imellem test serier ikke kan belyses. 8.2.2 CadmiumI alt 13 prøver med in vivo biotilgængelighed målt i EPA/svin blev test efter RIVM fastende uden tarm segment, figur 8.7. Figur 8.7 In vitro bioopløselighed af cadmium efter SBRC imod in vivo biotilgængelighed fundet i EPA/svin
Der var ikke lineær sammenhæng imellem in vitro og in vivo data, og in vitro data var generelt højere end in vivo data. Hovedparten af test resultaterne faldt i området 0.8-1.2, også for jordprøver med in vivo biotilgængelighed 0.6 eller derunder. En del af de her testede jorde er tidligere testet for cadmiums bioopløselighed efter en anden metode (IVG G /6/), men resultaterne opnået med de 2 metoder udviser ligeledes ikke lineær sammenhæng, figur 8.8. SBRC test resultaterne er alle, på nær for én jordprøve, i intervallet 0.8-1.0. Figur 8.8 In vitro bioopløselighed af cadmium opnået med en anden metode (IVG /6/) afbildet imod bioopløselighed opnået med SBRC
Denne test metode er ikke benyttet i andre faser af denne undersøgelse, hvorfor variationen imellem test serier ikke kan belyses. 8.3 Sammenligning af bioopløselighedsdata opnået med forskellige testmetoder for de hjemhentede prøverRepeterbarheden opnået ved test af dobbeltprøver viser, tabel 8.5, at kun RIVM fastende uden tarm segment har en væsentligt afvigende repeterbarhed (dårligere) for bly, formodentlig på grund af den utilstrækkelige fastholdelse af pH i testen. Tabel 8.5 Relativ standardafvigelse for dobbelttest sammenfattet for forskellige test metoder for bioopløselighed af metaller fra jord
For de testmetoder og metaller, hvor der er fundet lineær sammenhæng imellem in vitro og in vivo data, er i tabel 8.6 vist relativ bioopløselighed beregnet udfra valgte værdier af biotilgængelighed under anvendelse af de opnåede lineære regressionsligninger, se figur 8.10 og figur 8.11. De beregnede relative bioopløseligheder kan betragtes som et overslag på de resultater, der vil blive fundet ved test af jordprøver med de valgte værdier af relative biotilgængeligheder. Tabel 8.6 Relativ bioopløselighed beregnet udfra valgte værdier af biotilgængelighed baseret på lineær sammenhæng
For bly er de beregnede relative bioopløseligheder for både RIVM fastende uden tarm segment og SBRC høje ved lave biotilgængeligheder og lave ved høje biotilgængeligheder, men RIVM metoden er mest retvisende. For cadmium er RIVM fastende mest retvisende, mens relative bioopløseligheder med RIVM fastende uden tarm segment er meget høje sammenholdt med relative biotilgængeligheder. 8.3.1 BlyKun for SBRC metoden viser figur 8.9 en lineær sammenhæng imellem in vitro bioopløselighed og in vivo biotilgængelighed af bly fra jordprøver fundet i andre undersøgelser. Hvis kun testresultater opnået med RIVM fastende uden tarm segment med pH i testopløsningen under den specificerede maksimum værdi på 1.8 medtages, figur 8.10, viser både disse data og SBRC linear sammenhæng med omtrent samme korrelationskoefficienter (R²), hvor RIVM fastende uden tarm segment her giver den bedste overensstemmelse med in vivo data. Figur 8.9 In vitro biooopløselighed af bly opnået med de 3 afprøvede test metoder imod in vivo biotilgængelighed opnået i EPA/svin
Figur 8.10 In vitro biooopløselighed af bly opnået med de 3 afprøvede test metoder imod in vivo biotilgængelighed opnået i EPA/svin, RIVM fastende uden tarm segment kun prøver med test pH under 1.8
Selv med udelukkelse af prøver med for høj pH i mave segmentet viste RIVM fastende uoverensstemmelse imellem in vitro og in vivo data, figur 8.10. I denne fremstilling skulle desuden effekten af høj pH i tarm segmentet på bly bioopløselighed være kompenseret i udregningen af den relative bioopløselighed, se afsnit 5.3. Det må derfor konkluderes, at andre faktorer end pH giver afvigende bioopløselighed med RIVM fastende metoden. Samtidig er konstateret, at genfinding af tilsat bly i testen reduceredes væsentligt med jord i testen, se afsnit 5.1. På den baggrund er det sandsynligt, at andre komponenter tilsat med jorden, f.eks. fosfat, har bidraget til de i flere tilfælde meget lave bioopløseligheder med denne metode. På den baggrund og udfra den tidligere opnåede utilfredsstillende in vitro til in vivo korrelation for det samlede datasæt for RIVM fastende, figur 7.1, vurderes denne metode for bly ikke at give en tilfredsstillende in vitro bioopløselighed og overensstemmelse med biotilgængelighed som målt in vivo i dyr. Metoderne SBRC og RIVM fastende uden tarm segment vurderes begge for bly at give tilfredsstillende bioopløselighed og overensstemmelse med biotilgængelighed som målt in vivo i dyr, hvor RIVM fastende uden tarm segment har givet resultater med bedst overensstemmelse. Denne vurdering er dog betinget, at RIVM fastende uden tarm segment kan modificeres, således at pH i mave segmentet fastholdes under 1.8 for alle relevante jorde, uden at metodens resultater i øvrigt påvirkes. 8.3.2 CadmiumFor cadmium viser figur 8.11 den bedste lineære sammenhæng imellem RIVM fastende in vitro data og EPA/svin in vivo data og også den bedste generelle overensstemmelse in vitro til in vivo. RIVM fastende uden tarm segment viser også en lineær sammenhæng med in vivo data, mens dette ikke er tilfældet for SBRC. Både for RIVM fastende uden tarm segment og for SBRC, der begge simulerer opløsning alene i maven, viste alle prøver med biotilgængelighed over cirka 0.6 værdier for bioopløselighed omkring 1, dvs. fuldstændig opløsning af cadmium fra disse jordprøver. Samtidig var in vitro data for disse 2 metoder højere eller meget højere end in vivo data. På den baggrund og udfra den tidligere opnåede tilfredsstilelnde in vitro til n vivo korrelation for det samlede datasæt for RIVM fastende, figur 7.7, vurderes denne metode at give en tilfredsstillende in vitro bioopløselighed og den bedste overensstemmelse med biotilgængelighed som målt in vivo i dyr. Figur 8.11 In vitro biooopløselighed af cadmium opnået med de 3 afprøvede test metoder imod in vivo biotilgængelighed opnået i EPA/svin
8.4 Test af danske jordprøver med RIVM fastende uden tarm segment og SBRCÉn jordprøve fra hver af de 6 danske forurenede grunde, der tidligere var testet for metallers bioopløselighed, blev testet som dobbeltbestemmelser efter metoderne RIVM fastende uden tarm segment og SBRC, tabel 8.7 og tabel 8.8 for henholdsvis bly og cadmium. Tabel 8.7 Relativ bioopløselighed og gennemsnitlig præcision for test af jordprøver fra 6 danske, forurenede grunde, bly
For bly vurderes relative bioopløseligheder opnået med RIVM fastende metoden uden tarm segment at give det bedste estimat af relative biotilgængelighed for de 4 jorde med pH i mave segmentet under den maksimale værdi på 1.8, se afsnit 8.3. De relative bioopløseligheder for de 2 jorde med for høj pH i mave segmentet er formodentlig for lave med denne metode. Det skal bemærkes, at test af de samme danske jorde med RIVM fastende uden tarm segment og en mindre mængde jord (0.06 g imod standard 0.6 g) har vist pH under den specificerede maksimum værdi og relative bioopløseligheder nogenlunde svarende til de her opnåede for SBRC metoden, se tabel 8.7 (ikke offentliggjorte resultater fra {Oomen 2005 218 /id}). De relative bioopløseligheder opnået med SBRC metoden er formodentlig rimelige men relativt høje estimater af den faktiske biotilgængelighed af bly fra disse 6 jorde. De relative bioopløseligheder opnået med RIVM fastende metoden er for 4 jorde væsentligt under resultaterne opnået med de andre metoder, og samlet har denne metode formodentlig givet for lave estimater af den faktiske relative biotilgængelighed. Præcisionen ved test for bly af de danske jorde var sammenlignelig for de to RIVM metoder, men væsentlig bedre for SBRC, se også tabel 6.8. For cadmium vurderes relative bioopløseligheder opnået med RIVM fastende metoden at give det bedste estimat af relative biotilgængelighed, se afsnit 8.3. I overensstemmelse med diskussionen i afsnit 8.3 gav de danske jorde højere bioopløseligheder med RIVM fastende uden tarm segment og SBRC, og værdierne opnået med disse to metoder er formodentlig ikke gode bud på over den faktiske biotilgængelighed af cadmium fra disse jorde. Tabel 8.8 Relativ bioopløselighed og gennemsnitlig præcision for test af jordprøver fra 6 danske, forurenede grunde, cadmium
Præcisionen ved test for cadmium af de danske jorde var sammenlignelig for RIVM fastende og SBRC, men bedre for RIVM fastende uden tarm segment, se også tabel 6.8. Fodnoter [19] (): antal prøver i beregning [20] (): antal dobbelttest i beregning [21] -: ikke testet for Ni med denne metode [22] -: ikke lineær sammenhæng in vitro til in vivo [23] pH efter mave segment over den maksimale værdi på 1.8 [24] pH efter mave segment over den maksimale værdi på 1.8 [25] -: test for bioopløselighed gav resultat under testens detektionsgrænse
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
