Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 106 – Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers skæbne i mave-tarm kanalen - Studier af Bacillus thuringiensis

Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers skæbne i mave-tarm kanalen

Sammenfatning

Plantebeskyttelsesmidler baseret på bakterien Bacillus thuringiensis (Bt) bruges i Danmark ved produktion af bl.a. tomater, agurker og potteplanter. Bakteriens toksiske effekt overfor insekter skyldes dannelsen af såkaldte d-endotoksiner, som er giftige for visse insekter, men ufarlige for mennesker. Imidlertid producerer bakterien også enterotoksiner, som man kender fra madforgiftningsbakterien Bacillus cereus, og som kan give mennesker diarré.

Produkter baseret på Bt har været anvendt i flere årtier verden over uden at give erkendte problemer. Men da der er et øget krav til at reducere brugen af kemiske midler og da der er en stigende tendens til at spise rå eller let tilberedte grøntsager kan man forestille sig at der vil ske en større eksponering af forbrugerne for Bt, og dermed en øget risiko for eventuelle utilsigtede effekter af Bt.

Plantebeskyttelsesmidler baseret på Bt indeholder bakterien i form af sporer, som er en inaktiv (hvilende) og modstandsdygtig form af bakterien. Sporerne spirer til aktive celler i tarmen på de insekter de skal bekæmpe. Der har været en del diskussion om hvorvidt sporerne også er i stand til at spire i tarmen på pattedyr og mennesker efter indtagelse. Spore spiring og efterfølgende produktion af enterotoksiner vil kunne medføre en risiko for diarré hos forbrugere, der spiser grøntsager behandlet med Bt produkter. Hovedformålet med projektet var at afklare dette spørgsmål i en dyremodel. Dette formål blev undersøgt ved at teste følgende: 1) øger varmebehandling af Bt sporer deres evne til at spire i tarmen, 2) har Bt en effekt på sammensætningen af den omkringliggende tarmflora, 3) kan Bt danne enterotoksiner i tarmen, og 4) kan Bt overføre DNA til andre bakterier i tarmen?

Til at undersøge dette blev der brugt rotter med en tarmflora der ligner menneskers. Der blev lavet forsøg med en B. cereus stamme og to Bt stammer, der ligner de to Bt underarter, subsp. kurstaki og subsp. israelensis, der er tilladt på det danske marked. Endvidere blev der lavet forsøg med rotter uden tarmflora (kimfri rotter), der blev fodret med sporer af en Bt stamme, som fluorescerer grønt når cellerne er i vegetativ vækstfase. Forsøgene viste klart at Bt er i stand til at spire og gro i tarmen på kimfri rotter uden tilstedeværelse af en konkurrerende tarmflora. Også i rotter koloniseret med en menneske-tarmflora blev der observeret spiring og vækst i nogle af dyrene. Varmebehandling af sporer før fodring til rotterne øgede i dette forsøg ikke spiring. Dette indikerer at varmebehandling (f.eks. ved tilberedning) af grøntsager sprøjtet med Bt produkter ikke øger risikoen for at sporerne spirer i tarmen på forbrugerne.

Selvom der blev observeret spiring i rotterne med en menneske-tarmflora var bakterien forsvundet fra de fleste dyr to uger efter sidste fodring med bakterien. Der var dog ét dyr ud af seks doseret med Bt subsp. kurstaki, hvor stammen koloniserede tarmen, og i dette dyr sås også passage over mave-tarm barrieren til milten. Yderligere forskning er nødvendig for at klarlægge hvor stor risikoen er for at Bt invaderer via tarmen, og om dette kan ske hos mennesker.

En eventuel påvirkning af den omkringliggende tarmflora pga. fodring med Bt blev undersøgt både ved traditionel mikrobiologisk tælling på selektive plader og ved en molekylærbiologisk metode (denaturerende gradient gel elektroforese). Denne metode er baseret på analyse af et bestemt område af bakteriers kromosom, som vides at variere fra art til art. Disse variationer kan anvendes til at afgøre hvilke bakteriearter der er til stede. Dermed kan man lave en slags ”fingeraftryk” af bakteriepopulationen, som efterfølgende kan sammenlignes vha. computer analyse. Resultaterne viste, at fodring af rotterne med Bt sporer ikke medførte markante ændringer af tarmfloraen, og at de få ændringer der blev fundet ikke var permanente.

Ved brug af kimfri rotter fodret med sporer af to forskellige Bt stammer, blev der observeret udveksling af DNA mellem Bt stammerne i tarmen. Den ene stamme (donoren) indeholdt et såkaldt konjugativt plasmid, som blev overført til den anden Bt stamme (recipienten). Dette understøtter de førnævnte resultater vedr. spiring af sporer i mave-tarm kanalen. En sådan overførsel af et plasmid kan nemlig ikke ske mellem sporer, men kun mellem vegetative celler.

Udveksling af genetisk materiale mellem arter af B. cereus familien er velkendt i laboratoriet og er også observeret i tarmen på insekter, men det er første gang at en sådan udveksling er observeret i en mave-tarm kanal på et pattedyr. Ved sekventering af et Bt plasmid har man fundet stor lighed med andre plasmider fra B. cereus gruppen, samt plasmider fra andre Gram-positive bakterier, bl.a. bakterier naturligt forekommende i den menneskelige tarm. Denne lighed tyder på at der er sket udveksling af DNA i naturen, og et af miljøerne kunne være tarmen.

Desuden er en stammes evne til at overføre genetisk information til andre bakterier en vigtig faktor ved risikovurderingen af Bt midler. Hvis bakterien f.eks. er resistent overfor antibiotika, er det vigtigt at vide, hvorvidt denne resistens kan spredes til andre bakterier.

Toksinindholdet i prøverne blev målt ved at se på prøvernes evne til at dræbe dyrkede nyreceller fra en abe (Vero-celler). Ved at se på prøver af den væske, som de enkelte bakterier havde vokset i, var det klart at de Bt stammer, som bruges på spiselige afgrøder, producerede mindre toksin end de Bt stammer, der anvendes på potteplanter. Desuden lavede disse stammer en mindre mængde toksiner end en B. cereus stamme, der har været årsag til fødevareforgiftning.

Da de ydre omgivelser kan have stor indflydelse på, hvor meget toksin der produceres, blev toksinindholdet i tarmprøverne også undersøgt. Der kunne kun måles toksiner i et ud af seks kimfri dyr fodret med Bt subsp. israelensis (i lille mængde), mens der i prøver fra rotter med en menneskelig tarmflora fodret med Bt ikke kunne detekteres toksiner overhovedet. I undersøgelsen blev Bt sammenlignet med B. cereus, og heller ikke i dyr fodret med denne bakterie kunne der detekteres Vero-toksiske substanser eller observeres diarré hos rotterne. Forsøg med rotter er i øjeblikket det primære redskab til at teste sikkerheden ved nye biologiske bekæmpelsesmidler både i Danmark og i EU, men vores og andres resultater viser at dyreforsøg ikke altid er den bedste metode til at afsløre sygdomsfremkaldende egenskaber hos bakterier. Man kan ved at basere risikovurderingen på andre metoder dels opnå en bedre forbrugersikkerhed, dels spare nogle dyreliv.

Ved risikovurdering af Bt baserede insekticider fremover anbefales det at man lægger større vægt på undersøgelser af toksicitet i in vitro assays (f.eks. PCR analyser for virulensgener, celle-assays), og mindre vægt på rotteforsøg. Denne undersøgelse viser dog at dyreforsøg er anvendelige til at undersøge bl.a. bakteriens evne til at kolonisere tarmen, påvirkning af den omkringliggende tarmflora og udveksling af DNA med andre bakterier.

Da stammer af samme art kan være helt forskellige, anbefales det at der anvendes en case-by-case vurdering af hver enkelt stamme, og understreges at det er vigtigt at tage hensyn til brugen af det endelige produkt – f.eks. sprøjtning af enten grøntsager eller prydplanter. Denne undersøgelse viste f.eks. at Bt subsp. israelensis har høj cytotoksisk effekt, men da stammen i Danmark kun anvendes i forbindelse med produktion af potteplanter, er det næppe et problem for den almindelige forbruger, men kan være et arbejdsmiljø-problem.

Generelt giver denne undersøgelse ikke grund til øget bekymring omkring de midler, der er på markedet i dag. Selvom Bt subsp. kurstaki (som anvendes på grøntsager) kan spire i tarmen, danner stammen ikke høje koncentrationer af celle-dræbende toksiner. Dog kræver den observerede passage til milten flere studier af netop denne stamme for at klarlægge om en sådan passage også kan ske i mennesker.

Udover at almindelige forbrugere, kan gartneriarbejdere der sprøjter med Bt, også blive ’eksponeret for Bt. Selvom mange af resultaterne selvfølgelig også gælder for de ansatte har vi ikke specifikt kigget på evt. arbejdsmiljøproblemer. Denne problematik har været undersøgt i et tidligere projekt støttet af bl.a. Arbejdstilsynet [Jensen et al., 2001].