| Forside | | Indhold | | Forrige |

Udvikling og validering af en metode til analyse af kolophonium i kosmetiske produkter

Bilag B: En metode til kvantificering af harpikssyrer i kosmetik

Kemikalier

Cis-5,8,11,14,17-eicosapenraenoinsyre (EPA, >98,5 %) og abietinsyre (CAS-nr. 514-10-3, teknisk kvalitet, 75 %). Begge fra Fluka.
Pimarinsyre (CAS-nr. 510-39-4)og dehydroabietinsyre (CAS-nr. 1740-19-8) er begge fra HelixBiotech og 7-oxo-dehydroabietinsyre (CAS-nr. 18684-55-4) er syntetiseret i henhold til Ayer og Migaj (1989).

Standardopløsninger til HPLC laves i acetonitril: MilliQ vand 9:1 med 0,2 % myresyre. Opløsningerne opbevares på køl og er stabile i mindst 2 uger.
Kolofonium prøver opløses i 100 % acetonitril i en cirka koncentration på 1,5 mg/ml

Prøver

Metoden er blevet testet på voks strips, foundation, rouge og mascara.

Procedure

Ekstraktion:

1 til 2 g prøve (1 g for voks strips og mascara) ultralysbehandles med 20-100 ml acetonitril (afhængig af prøvetype) i 30 minutter. Voks strips klippes i stykker. Papirerne fjernes for at opnå kontakt mellem voks og solvent.
500 ml EPA fra en 928 mikrogram/ml opløsning tilsættes som intern standard (IS) før ekstraktion.

For alle kosmetik prøver undtagen voks strips: Hvert ekstrakt overføres til plastrør og centrifugeres i 15 min. ved 4000 rpm. Supernatanten overføres til en kolbe, bundfaldet genopløses i acetonitril, ultralydbehandles og centrifugeres efter samme procedure. Supernatant fraktionerne samles og inddampes ved hjælp af rotationsinddamper til et volumen på cirka 5 ml. Volumenet justeres til 7 ml med acetonitril. MilliQ vand tilsættes til et slutvolumen på 10 ml indeholdende Acetonitril:vand i forholdet 7:3.
Tilsætning af vand gør opløsningen uklar. Opløsningen filtreres derfor gennem et sprøjtefilter (0,45 mikrometer polypropylene membranfilter).

Note: Kontroller at filtret kan tåle acetonitril.

Til voks strips: Efter ultralydsbehandling, inddampes prøven ved brug af rotationsinddamper, til ca. 5 ml. Volumenet justeres til 7 ml med acetonitril. MilliQ vand tilsættes til et slutvolumen på 10 ml indeholdende Acetonitril:vand i forholdet 7:3. Prøven overføres til plastrør. Kolben skylles med en lille mængde acetonitril, der også overføres til røret. Prøven centrifugeres ved 4000 rpm i 15 min. Supernatanten overføres direkte til en konditioneret SPE kolonne, uden filtrering.

Fastfase ekstraktion (SPE):

Der anvendes Oasis MAX kolonne (6cc, 500mg) fra Waters til oprensning. Konditionering af SPE kolonne foretages ved eluering med 1) 3 ml methanol og 2) 3 ml MilliQ vand. Prøven påsættes og kolonnen skylles med 1) 3 ml 50 mM NaOAc i MilliQ vand, 2) 4 ml methanol og til sidst 1 ml 2 % myresyre i methanol. Prøven elueres med 2 ml 2 % myresyre i methanol. Der tilsættes yderligere 1 ml myresyre i methanol i tilfælde af gennembrud. 3 fraktioner gemmes: 1) sidste skyllefraktion (1 ml) 2) elueringsfraktionen (2 ml) og 3) den sidste ekstra fraktion (1 ml). Kun elueringsfraktionen analyseres.

Note 1: Forholdet acetonitril:vand 7:3 i prøven er vigtigt for en god genfinding ved oprensning på SPE.
Note 2: Myresyre opløsningen skal laves frisk hver dag. Det er meget vigtigt for genfindingen at opsamle nøjagtig volumen af elueringsfraktionerne.

Til kolofonium prøver: Intern standard (IS), 200 mikroliter (186 mikrogram) tilsættes til en 1,5 mg/ml kolofonium opløsning. Kolofonium prøver analyseres direkte efter filtrering på HPLC (uden oprensning på SPE).

HPLC:

HPLC system skal være udstyret med et 20 mikroliter injektionsloop, en diode array detektor (DAD) og en kolonne termostat sat til 25 °C. HPLC kolonnen er en Rp-12 (4,6mm i.d., længde 150mm, partikelstørrelse 3 mikrometer). Den stationære fase indeholder både C12-kæder og urea funktioner. Methanol:vand 8:2 med 0,05 % myresyre bruges som mobil fase med et flow på 1 ml/min (hvilket giver et tryk på 240 bar). Der anvendes en isokratisk eluering (konstant koncentration og sammensætning af mobil fase). Der måles på fire forskellige bølgelængder 210, 220, 240, og 250 nm. De forskellig absorptions forhold anvendes til identifikation af de enkelte komponenter.

Note: Der anvendes isokratiosk eluering for at undgå en stigende basislinje, som vil medføre højere LOD værdier. Mængden af myresyre er vigtig for både retentionstiden og støjniveau på basislinjen.

Kromatogrammer af en standard opløsning (200 ng/µl) ved de enkelte bølgelænger er vist på næste side.

De forskellig absorptions forhold til brug til identifikation (CV under 10 %).

Det anbefales dog at kontrollere de specifikke absorptionsforhold på rene standarder, da disse kan variere afhængig af detektor..

Top 1 = 7-oxo-dehydroabietinsyre
Top 2 = Dehydroabietinsyre
Top 3 = EPA, intern standard
Top 4 = Pimarinsyre
Top 5 = Abietinsyre

Metoden er udviklet af Ulrika Nilsson og Nagmeh Berglund, Afd. for Analytisk Kemi, Stokholm Universitet, Sverige

Reference

Ayer, W. A. and Migaj, B. S. Acids from blue-stain diseased lodgepole pine. Can J Bot. 1989: 67: 1426-1428