| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Effekter af pyrethroidet lambda-cyhalothrin på biologisk struktur, funktion og rekolonisering i vandløb

2 Metoder

• 2.1 Betydning af økosystemstruktur og –funktion for rekolonisering efter pyrethroidpåvirkning
  • 2.1.1 Pyrethroideffekter på diversitet, rekolonisering og stofomsætning i naturlige vandløb
  • 2.1.2 Rekolonisering af og stofomsætning i modelvandløb efter pyrethroidpåvirkning
• 2.2 Pyrethroideffekt på smådyrs mobilitet, evne til restituering, samt substrat- og fødekvalitet
  • 2.2.1 Stofomsætning hos forsøgspopulationer af smådyr i små strømrender efter pyrethroidpåvirkning
  • 2.2.2 Restitueringsevne hos Gammarus pulex (pilotforsøg)
  • 2.2.3 Restitueringsevne og fødesøgning hos udvalgte iturivere
  • 2.2.4 Overlevelse og fødesøgning hos græsseren Heptagenia sulphurea
• 2.3 Langdistance-kolonisering hos smådyr i fynske vandløb
• 2.4 Statistiske Metoder
  • 2.4.1 Betydning af økosystemstruktur og –funktion for rekolonisering efter pyrethroidpåvirkning
  • 2.4.2 Pyrethroideffekt på smådyrs mobilitet, evne til restituering, samt substrat- og fødekvalitet
  • 2.4.3 Langdistance-kolonisering hos smådyr i fynske vandløb
• 2.5 Kvantificering af lambda-cyhalothrin
  • 2.5.1 Forbehandling af vandprøver
  • 2.5.2 Fastfaseekstraktion
  • 2.5.3 LC-MS analyse
  • 2.5.4 Lambda-cyhalothrin-koncentrationer

2.1 Betydning af økosystemstruktur og –funktion for rekolonisering efter pyrethroidpåvirkning

2.1.1 Pyrethroideffekter på diversitet, rekolonisering og stofomsætning i naturlige vandløb

Der blev udvalgt 3 forsøgsvandløb inden for hver af størrelseskategorierne: Små, mellemstore og store vandløb (Tabel 2.1). Samtlige vandløb er beliggende i Gudenå-systemet, der er Danmarks største vandløbssystem. I hvert vandløb blev til forsøgene udvalgt en strækning, der ikke eller kun i ganske svag grad er påvirket af menneskelig aktivitet. Strækningerne er således dels relativt uregulerede, dels – i forhold til deres størrelse – i besiddelse af en meget artsrig smådyrsfauna med forekomst af flere arter, som vides at kræve stort set uforurenet vand. Faunaen i disse vandløb har været konstant artsrige gennem en årrække, hvilket indikerer, at der ikke i væsentligt omfang er forekommet periodevise tilførsler af pesticider. Der er derfor ikke foretaget nogen undersøgelse af en mulig baggrundsbelastning med pesticider i forbindelse med feltforsøgene. Langs samtlige undersøgte lokaliteter i de 9 vandløb forekom trævækst i den ripariske (brednære) zone, men ikke som tæt skyggende bevoksning. Kun Sdr. Vinge Bæk kunne karakteriseres som et egentligt skovvandløb.

Tabel 2.1. Oversigt over vandløb i Guden Å systemet, hvori projektets feltforsøg foregik. Angivet UTM koordinater (ED50).

De samme vandløb blev anvendt til feltundersøgelser både forår- og efterår 2006.

Under forårs- og efterårsforsøget blev der på hver af de 9 vandløbsstrækninger udlagt en række kunstige substrater i et tilfældigt mønster:

• Forår: Groft grus (kornstørrelse 16-32 mm) blev udlagt i mærkede cirkulære plastkopper fastgjort til en jernkæde (Figur 2.1.1). Kopperne, der hver havde et areal på 95 cm² (diameter 110 mm, højde 35 mm), blev udlagt i vandløbene primo til medio maj 2006. Her blev de konditioneret, dvs. koloniseret med alger og dyr, inden de efter ca. 28 dage blev anvendt i de egentlige forsøg.
• Efterår: Bladpakker - hver bestående af ca. 2 g visne bøgeblade - omgivet af et plastiknet med maskevidde 5 mm og fastgjort med plaststrip til en stump plastikrør. Gennem de enkelte bladpakkers plastrør var stukket et metalrør, der i hver ende var fastgjort til en jernkæde (Figur 2.1.2). Bladene blev indledningsvis indsamlet direkte fra skovbunden, tørret ved 60 °C i 1-2 døgn og afvejet. Dernæst blev de afvejede blade placeret i separate bøtter til opblødning ét døgn, inden de blev anbragt i plastiknettene (bladpakker). Disse bladpakker blev nummereret og udlagt i forsøgsvandløbene i perioden 7.-21. november 2006. Her blev de konditioneret (dvs. koloniseret med mikroorganismer) og koloniseret med smådyr, indtil de efter ca. 20-22 dage blev anvendt i de egentlige forsøg. Tørre bøgeblade, der anbringes i vand, vil tabe 1,2-1,8% af deres vægt som opløst organisk stof (Iversen & Madsen 1977). Dette tab blev ikke indregnet i vores forsøg, idet det skønnedes betydningsløst i forhold til tab i form af fysisk nedbrydning af bladene.

Begge typer substrater blev placeret på steder med stryg-karakter for at mindske risikoen for tilsanding. Jernkæderne blev fastholdt af et jernanker og desuden af jernpløkke.

Figur 2.1.1. Kunstige substrater, her gruskopper (plasticbeholdere indeholdende groft grus), udlagt i Hagenstrup Møllebæk. De enkelte gruskopper var individuelt mærket og fastgjort til jernkæde med plaststrips.

Figur 2.1.2. Kunstige substrater, her bladpakker (groftmasket plasticnet indeholdende 2 g bøgeblade), udlagt i Hagenstrup Møllebæk. De enkelte bladpakker var individuelt mærket og fastgjort til jernrør forbundet af jernkæder.

Forsøgene med hhv. groft grus og bladpakker som kunstige substrater blev udført efter samme princip. Figur 2.1.3 viser en principskitse for forsøgene. De kunstige substrater fra hvert vandløb - i alt 96 (+ 12 ekstra til evt. erstatning af substrater, som måtte gå tabt under forsøget) - blev individuelt mærket i forhold til deres placering langs kæden. Tre-fire uger efter udlægning, hvor det formodedes at substraterne var blevet tilstrækkelig koloniseret med dyr fra det pågældende vandløb, blev substraterne indsamlet. Under selve optagningen af substraterne blev hvert substrat hurtigt (og nede i selve vandløbet) anbragt i en netpose med maskevidden 500 µm for at forhindre tab af dyr. Fra hver lokalitet blev 6 substrater straks konserveret i 96% ethanol, mens de øvrige blev eksponeret i 90 min. i tre transportable forsøgsrender (Figur 2.1.4). Disse forsøgsrender var 60 cm brede, 2 m lange og 20 cm høje og blev under eksponeringen tilført vand fra det lokale vandløb, svarende til ca. 2½ l min^-¹. Vandet blev ved hjælp af en dykpumpe pumpet op i 3 tanke, hver indeholdende 1 m³, hvorfra vandet blev ledt til de 3 render. Vandhastigheden gennem forsøgsrenderne var således væsentligt under 1 cm s^-¹. 30 (+4 ekstra) substrater blev eksponeret i rent vandløbsvand (kontrolprøver), mens de resterende 2 x 30 (+2 x 4 ekstra) substrater blev eksponeret i vandløbsvand tilsat lambda-cyhalothrin i nominelle koncentrationer på hhv. 0,5 µg l^-¹ (lav) og 5,0 µg l^-¹ (høj). I flere tilfælde var der op til 15 min.’s transporttid fra vandløbet til stedet, hvor der blev eksponeret. Efter endt eksponering blev 6 substrater fra hver forsøgsrende (i alt 18 prøver) udtaget af de net, som de var placeret i, og hhv. selve grussubstratet og netposens indhold konserveret i 96% ethanol hver for sig. De resterende prøver blev genudlagt i vandløbet på den position, som de oprindeligt havde. Substraterne blev udtaget af netposerne umiddelbart før placeringen i vandløbet. Netposernes indhold blev individuelt konserveret i 96% ethanol. Netposerne havde således til formål at opsamle de dyr, som måtte have forladt substratet under optagningen fra vandløbet, eksponeringen i forsøgsrenderne og for flertallets vedkommende også under genudlægningen. Der blev herefter indsamlet 3 x 6 substrater fra vandløbet (6 for hver behandling under eksponeringen) på hhv. dag 1, 7, 15 og 30 efter eksponeringen. Disse substrater blev direkte konserveret i 96% ethanol (uden opsamling af de dyr, som måtte undslippe under håndteringen). Efterfølgende blev dyrene fra substrat- og netprøverne udsorteret, bestemt til lavest mulige taxonomiske niveau (se Boks 2.1) og optalt i laboratoriet, ligesom der er bestemt hhv. klorofyl-a indhold på grusmaterialet og tørvægt af bladpakkerne.

Klik her for at se figur 2.1.3

Klorofyl-a blev målt spektrofotometrisk direkte på ethanolekstraktet af de fikserede gruskop prøver (Dansk Standard 1986), og koncentrationen angivet som µg l^-¹ som et mål for algebiomassen på substratet.

Figur 2.1.4. De kunstige substrater (her gruskopper) blev efter en indledende koloniseringsperiode taget op af det enkelte forsøgsvandløb og (bortset fra 6 såkaldte før-prøver) fordelt tilfældigt i tre forsøgsrender. Mens den ene rende fungerede som kontrol og fik tilført alm vand, fik de to øvrige tilført vand med tilsat lambda-cyhalothrin i koncentrationer på hhv. 0,5 og 5,0 µg l^-¹. Denne eksponering varede 90 min., hvorefter substraterne (bortset fra 6 fra hver rende, der straks blev konserveret) blev genudlagt i vandløbet. På billedet ses nærbillede af kontrolrenden. Hver gruskop er anbragt i et net til opsamling af smårdyr, som måtte forlade substratet før, under og efter eksponeringen. Der pumpes vand op i plastbeholderen. hvorfra det løber til forsøgsrenden, der har afløb i den fjerneste ende.

De enkelte substraters placering i vandløbene var både i forhold til behandling og tidspunkt for optagning gjort tilfældig.

Samtidig med udlægningen af substraterne samt på dag 1 og 30 blev der på hver lokalitet udtaget en semi-kvantitativ sparkeprøve (ketcher med netpose med maskevidde 500 µm) til en overordnet karakteristik af artssammensætningen af smådyrsfaunaen.

Endelig blev der på dag 1 og 30 indsamlet prøver af driftende smådyr fra selve vandløbet. Der blev i hvert tilfælde anvendt 3 driftnet (med maskevidde 500 µm) opsat i en 3-timers periode umiddelbart efter solnedgang.

I Stavis Å på Fyn blev der udført et supplerende forsøg med kolonisering og omsætning af pyrethroid-eksponerede blade. Der blev herved anvendt samme type bladpakker, som ved de oven for beskrevne forsøg. Her blev imidlertid udlagt i alt 50 (+10 ekstra) ueksponerede bladpakker og 50 (+10 ekstra) pyrethroideksponerede bladpakker. Der blev anvendt bøgeblade, som indledningsvist blev tørret i 2 døgn ved 105 ^oC, hvorefter der blev afvejet portioner af ca. 2 g, der blev konditioneret i 7 døgn i beluftet åvand (for at undgå anaerobe forhold). Herefter blev halvdelen af portionerne eksponeret i 90 min. i vand med 5,0 µg lambda-cyhalothrin l^-¹, inden samtlige portioner blev placeret i netposerne. Netposerne blev udlagt 4. december 2007. Herefter blev der på dag 3, 7, 15, 30 og 60 efter udlægningen indsamlet hhv. 10 pyrethroid-eksponerede bladpakker og 10 kontrolbladpakker. Disse blev udvalgt stratificeret tilfældigt. Bladpakkerne blev optaget som ved feltforsøgene i de jyske vandløb, konserveret i 96% ethanol og smådyrene frasorteret, identificeret og optalt, mens bladmaterialet i pakken blev tørret og vejet. Forsøget blev udført på en ureguleret strækning af Stavis Å, hvor denne passerer gennem Langesø Skov. Vandløbet har her en god miljøkvalitet uden tegn på påvirkninger af hverken spildevand eller pesticider. Bladpakkerne blev udlagt på et stryg på samme måde som ved feltforsøgene i de jyske vandløb. Data for vandføring og vandtemperatur i vandløbet under forsøget blev indhentet fra Miljøcenter Odenses automatiske målestation, beliggende ca. 7 km nedstrøms for forsøgsstrækningen.

2.1.2 Rekolonisering af og stofomsætning i modelvandløb efter pyrethroidpåvirkning

I dette forsøg blev det i kunstige vandløb undersøgt, hvorledes indvandringen af smådyr foregår, efter at disse vandløb var blevet påvirket ved tilførsel af pyrethroid. Samtidig blev sammenhængen mellem tilstedeværelsen af smådyr og stofomsætningen undersøgt for at opnå en beskrivelse af den indirekte effekt af pyrethroidpåvirkningen. Forsøget blev gennemført i efteråret 2007.

Der blev indledningsvis opbygget i alt 6 forsøgsrender, hver med en længde på 12 m og en brede på 0,60 m (Figur 2.1.5-2.1.6). Renderne blev opbygget med en bund af metalplade og 30 cm høje sider af akrylplast. Hver rende var placeret på et stativ af træ (hvilende på en række fliser på et underlag af stabilgrus) og havde en hældning på 5‰. Hver rende blev forsynet med bundsubstrat af forskellige fraktioner af sten, grus og sand, som blev fordelt efter samme princip. I hver rende blev der således lavet i alt 5 stryg, hvoraf det ene var placeret midtvejs og derved opdelte renden i en opstrøms og en nedstrøms del. I hver af de to halvdele var der således placeret to stryg. Den midterste del af hvert stryg bestod af marksten op til ca. 15 cm i diameter og såvel ca. 0,6 m opstrøms og ca. 0,6 m nedstrøms for disse af småsten og groft grus i kortstørrelserne 48-96, 24-48 og 12-24 mm. Forholdet mellem de 3 kornstørrelser var 1:4:4. Imellem strygene var der områder med dybere vand (høller), i alt 6 høl-sektioner, hvor bunden blev opbygget af finere fraktioner med kornstørrelserne 6-12, 3-6 og 1-3 mm i forholdet 1:1:0,5. Tykkelsen af bundsubstratet varierede fra ca. 5-6 cm i høl-sektionerne til 10-20 cm i strygene (højest ved stenene).

Figur 2.1.5. Oversigt over de 6 forsøgsrender (kunstige vandløb) i Lemming. Hver rende er 12 m lang, anbragt på bukke af træ, og har en hældning på 5 ‰.

Figur 2.1.6. Afløbsenden af én af de 6 forsøgsrender i Lemming. Ud fra vandspejlshøjden i det skarpkantede V-overfald kan vandføringen gennem renden beregnes.

Solindstrålingen til renderne blev dæmpet ved hjælp af en dug af hvidt stof fastgjort til træstativerne. Derved reduceredes lysindfaldet med ca. 66%. Formålet var at forhindre opvarmning af vandet og mindske uhæmmet opvækst af bundlevende trådalger.

Renderne blev kontinuert tilført vand fra den nærliggende Lemming Å. Via to rør blev åvandet naturligt ledt ind i et mindre bassin, hvori var placeret en aksialpumpe med en maksimal ydelse på ca. 45 l s^-¹. Vandet blev fra bassinet pumpet ca. 2 m op i et pumpetårn, opbygget af brøndringe med en diameter på 120 cm. Herfra blev vandet ført videre via naturligt fald i tætte pvc-rør til endnu en brønd placeret umiddelbart nær ved renderne. Herfra blev vandet, stadig via naturligt fald, fordelt via 6 pvc-rør til hver sin rende. I indløbsenden af hver rende var anbragt en fordelerkasse af metal, således at indløbsvandet blev nogenlunde jævnt fordelt. Vanddybden i renderne (over substratet) varierede mellem 2-3 cm over toppen af strygene til ca. 20 cm i høl-sektionerne. Det resulterede i en variation i den gennemsnitlige vandhastighed gennem tværsnittet af renderne på 3-30 cm s^-¹. Udløbsenden af hver rende var forsynet med et 60° skarpt overfald til bestemmelse af vandføringen igennem renden (Figur 2.1.6). Vandstrålen ud gennem overfaldet var ”luftet” (dvs. havde frit fald), således at vandføringen ved måling af vandspejlets højde i overfaldet og standardformel kunne beregnes. Afløbsvandet fra hver rende blev via to samlebrønde og udløb ledt tilbage i Lemming Å, kun ca. 10-15 m nedstrøms for indvindingsstedet. Der blev indhentet tilladelse til indvindingen fra Silkeborg Kommune (jf. Vandforsyningsloven).

Funktionen af aksialpumpen blev overvåget med en telefonisk alarm, og der var mulighed for med kort varsel at tilslutte en reservepumpe (dog med mindre ydelse).

Den 28. august 2007 var renderne færdigt opbyggede og blev tilført åvand som beskrevet ovenfor.

Den 19. september 2007 blev der i hver rende udlagt i alt 30 (+ 1-2 ekstra) bladpakker af samme type og med samme indledende behandling som under feltforsøgene i de 9 midtjyske vandløb (se afsnit 2.1.1). Der blev placeret 5 bladpakker i hver af de 6 høl-sektioner. Bladpakkerne havde derefter i løbet af 10 dage mulighed for at blive konditioneret (koloniseret med mikroorganismer).

Den 28. september 2007 blev renderne koloniseret med smådyr fra Lemming Å. Dette foregik ved indsamling af sparkeprøver over en ca. 100 m strækning jf. metode angivet i Miljøstyrelsen (1998). Der blev kun taget prøver i områder med karakter af stryg. Der blev startet nedstrøms fra, idet første prøve blev anbragt i en spand mærket nr.1, anden prøve i en spand mærket nr. 2, og så videre indtil 6. prøve, som blev placeret i spand nr. 6. Herefter blev 7. prøve anbragt i spand nr. 1, 8. prøve i spand nr. 2 osv., indtil der i alt var 5 prøver i hver af de 6 spande. Formålet med den valgte procedure var at sikre en ensartet artssammensætning af smådyr i hver spand. Antallet af prøver skulle endvidere sikre en naturlig individtæthed i renderne. Podningen med dyr foregik ved, at dyrene i spand nr. 1 blev tilført opstrøms i rende 1, dyrene i spand nr. 2 tilført rende 2 osv.

Frem til den 29. oktober (dvs. i løbet af 31 dage) havde smådyrene mulighed for at fordele sig i renderne og bl.a. kolonisere de udlagte bladpakker. Den 30. oktober blev den nedstrøms halvdel (6 m strækning) af renderne nr. 1, 2 og 4 (efter tilfældig udvælgelse) eksponeret i 90 min. med en nominel koncentration af lambda-cyhalothrin på 5,0 µg l^-¹. De øvrige render blev ikke eksponeret og fungerede således som kontrolrender. Under eksponeringen blev der ved hjælp af en pumpe (Ole Dich Instrumentmakers ApS, Danmark, Type 110AC R40 G38 CH10A) doseret med en stamopløsning af pesticidet, som blev fordelt i hele en rendens bredde via en ”10-huls diffuser”. Ved et indledende forsøg var det ved hjælp af farvestof kontrolleret, at det doserede stof inden for ca. ½ m ”strækning” blev effektivt opblandet i hele rendens vandføring (Fig. 2.1.7). Efter 60 minutters eksponering blev der udtaget vandprøver til bestemmelse af de aktuelle koncentrationer af lambda-cyhalothrin.

Figur 2.1.7. Ved brug af grønt farvestof er her vist, hvorledes der over en 90 min’s periode blev doseret lambda-cyhalothrin i en koncentration på 5,0 µg l^-¹ til den nedre halvdel af tre af de 6 forsøgsrender i Lemming. Det ses, at farvestoffet opblandes effektivt allerede få cm nedstrøms for doseringsstedet.

Under og 30 min. efter eksponeringen blev det pesticidholdige vand opsamlet i et til formålet indrettet opsamlingsbassin for at forhindre kontaminering af Lemming Å.

Vandtemperaturen i hhv. Lemming Å og rende 4 blev målt kontinuert ved hjælp af temperaturlogger.

Sammensætningen af smådyr i renderne blev undersøgt ved indsamling af prøver fra hhv. strygene og høllerne. Fra strygene blev indsamlet prøver fra bunden ved hjælp af en såkaldt Surber-sampler med et areal på 200 cm². Ved prøvetagningen blev sampleren presset ned i bunden og substratet inden for rammen hvirvlet op ved brug af en 3-grenet håndkultivator (normalt anvendt til håndlugning i haven). Det ophvirvlede materiale blev derved skyllet ind i og opsamlet i samplerens netpose (maskevidde 500 µm). Indholdet af netposen blev konserveret i 96% ethanol og dyrene frasorteret, identificeret og optalt. Der blev indsamlet Surberprøver hhv. dagen før (dag -1) og 7 og 30 dage efter eksponeringen med pyrethroid. I hver halvdel (længde 6 m) af en rende blev på disse tidspunkter indsamlet i alt 5 prøver således: Hvert område med stryg blev nedstrøms for ”stentærsklen” inddelt i 4 x 4 felter (hvert felt svarende til størrelsen af en ”Surber-sampler”), hvilket i alt gav 36 potentielle prøvefelter i den opstrøms halvdel og 48 potentielle prøvefelter i nedstrøms halvdel af renden. Blandt disse potentielle prøvefelter blev ved den enkelte prøvetagning stratificeret tilfældigt udvalgt 2 x 5 prøver pr. rende, i alt 60 prøver for samtlige render. Derved blev, eftersom der aldrig blev taget prøver på en tidligere anvendt udtagningsposition, 30-40% af det potentielle prøvetagningsareal og 8% af det samlede rendeareal berørt af prøvetagningen.

Fra høllerne blev der indsamlet bladpakker på samme tidspunkter som Surber prøverne. Og i dette tilfælde blev der på den enkelte prøvetagningsdag - og i hver rendehalvdel – indsamlet 5 bladpakker udvalgt stratificeret tilfældigt. Prøverne blev behandlet på samme måde som prøverne fra feltforsøgene (se afsnit 2.1.1).

Tilførslen (”drift”) af smådyr via det indpumpede åvand blev undersøgt i tre perioder (over 3 timer den 29. oktober, over 8,75 dagtimer den 14. november, og 15 nattetimer den 14.-15. november), idet dyrene blev opsamlet i net (maskevidde 500 µm), som filtrerede alt det indstrømmende vand. Der blev målt i tre tilfældigt udvalgte render (3, 4 og 6). Derudover blev transporten af dyr ud af samtlige 6 render målt under behandlingen med pyrethroid (1,5 timer) samt over 2 timer derefter, idet alt det udstrømmende vand blev filtreret gennem net (maskevidde 500 µm) placeret i afløbet fra renderne. Dyrene opsamlet i nettene blev konserveret i 96% ethanol, udsorteret, identificeret og optalt.

2.2 Pyrethroideffekt på smådyrs mobilitet, evne til restituering, samt substrat- og fødekvalitet

I tidligere MST-projekter er 12 små strømrender i Lemming blevet anvendt primært til kortvarige studier (typisk af 1-2 dages varighed) af driftsadfærd hos pyrethroideksponerede invertebrater (Møhlenberg et al., 2004; Nørum et al., 2006). I nærværende projekt var der planlagt forsøg i disse render. Forsøgene skulle løbe over en 7-dages periode i foråret 2007 og omfatte en række forsøg med krebsdyret Gammarus pulex, samt vårfluerne Chaetopteryx villosa og Sericostoma personatum. Forsøgene måtte imidlertid opgives pga. problemer med vandkvalitet, uanset om grundvand eller åvand blev anvendt. Således førte anvendelse af åvand til hurtig opvækst af trådformede alger, der tilstoppede det i rendeafløbene anbragte finmaskede net, som skulle forhindre forsøgsdyrene i at undslippe. Resultat var, at vandet løb ud over kanterne af renderne og en stor del af forsøgsdyrene undslap. Anvendelsen af grundvand førte til kraftige udfældninger af okker efter få dage, hvilket påvirkede forsøgsdyrenes almentilstand betydeligt.

I stedet blev et system af små strømrender opbygget i sommeren 2007 i laboratoriet ved SDU. Dette forbedrede system bestod af 30 render (6 grupper med n=5), mod de oprindeligt planlagte 12 (3 grupper med n=4) i Lemming, hvilket muliggjorde en væsentlig udvidelse af de planlagte forsøg. Mens det således oprindeligt kun var meningen at undersøge pyrethroid-eksponerede dyrs omsætning af ukontamineret bladmateriale, kunne derved også ueksponerede dyrs omsætning af pyrethroid-kontamineret bladmateriale kvantificeres. Forsøg blev gennemført med G. pulex og S. personatum. Forsøgsdesignet i disse undersøgelser, der gennemførtes med små forsøgspopulationer, svarede dermed til designet i videosporings-forsøgene (beskrevet nedenfor), der foregik på individniveau, hvorved muligheden for at dokumentere betydningen af dyrenes interaktioner blev forøget.

En række forsøg blev gennemført for at kvantificere invertebraters mobilitet før, under og efter en pyrethroidpuls, ligesom dyrenes evne til at komme sig (restitueringsevnen) blev bestemt. I disse forsøg blev dyrenes bevægelsesadfærd registreret ved hjælp af videosporingssystemet, EthoVision Pro (Noldus Information Technology, Holland). Videosporingsmetodikken er tidligere beskrevet i Nørum & Bjerregaard (2003) og Nørum et al. (2006). Som beskrevet for forsøgene med stofomsætningen hos forsøgspopulationerne i de små strømrender blev såvel pyrethroid-eksponerede dyrs omsætning af ukontamineret bladmateriale, som ueksponerede dyrs omsætning af pyrethroid-kontamineret bladmateriale, bestemt. Indledningsvist blev et pilotforsøg med G. pulex gennemført med henblik på at fastlægge forsøgsdesignet til de efterfølgende studier. Forsøg blev derefter gennemført med fire ituriverne: krebsdyret G. pulex, slørvingen Leuctra nigra, og vårfluerne S. personatum og C. villosa. For at supplere de oprindeligt planlagte studier af iturivere, der omsætter bladmateriale, blev effekten af pyrethroider på gruppen af græssere, der omsætter mikroalger, undersøgt i et forsøg med døgnfluen Heptagenia sulphurea.

Alle forsøgene blev udført ved 14-15 °C med en døgnrytme med 12 timers lys og 12 timers mørke. Til forsøgene med G. pulex, L. nigra, S. personatum og C. villosa blev kunstigt ferskvand anvendt, mens forsøget med H. sulphurea blev udført med åvand fra indsamlingsstedet i Sallinge Å. Det kunstige ferskvand bestod af omvendt osmose vand (ASTM Type 4) tilsat følgende salte (OECD 2004): CaCl₂·2H₂O: 294 mg l^-¹, MgSO₄·7H₂O: 123,25 mg l^-¹, NaHCO₃: 64,75 mg l^-¹, KCl: 5,75 mg l^-¹. De anvendte forsøgsdyr blev akklimatiseret til forsøgsbetingelserne i mindst 2 dage inden forsøgsstart. I alle forsøgene blev fødematerialet (blade og mikroalger) skyllet grundigt efter endt eksponering for at sikre at alt løst adsorberet lambda-cyhalothrin blev fjernet, hvilket ville være tilfældet efter en kortvarig pulseksponering i et naturligt vandløb. Først derefter blev føden givet til dyrene.

2.2.1 Stofomsætning hos forsøgspopulationer af smådyr i små strømrender efter pyrethroidpåvirkning

Forsøgsopstillingen bestod af to reolsystemer, hver med tre lag à 5 render (Figur 2.2.1a). I hvert lag delte renderne vand, således at vandet blev ledt til de fem render fra et fælles fødekar via fem justerbare haner. Vandføringen i den enkelte rende var 1,5 l min^-¹, strømhastigheden i gennemsnit ca. 4 cm s^-¹, og vanddybden over substratet 1-2 cm. Ved udløbsenden af hver rende løb vandet gennem et fintmasket net (maskevidde: 1 mm), der tilbageholdt dyrene, ned i et opsamlingskar (Figur 2.2.1c), hvorfra vandet ved hjælp af en akvariepumpe (Eheim, cirkulationspumpe 1046-21) blev pumpet retur til fødekarret. Til fem render i et lag blev 100 l kunstigt ferskvand anvendt.

Figur 2.2.1. De små strømrender: a) Reolsystemer. b) Render med småsten, samt større sten med konditionerede bøgeblade udlagt under opstrømsenden. c) Udløbsenden med fintmasket net, der tilbageholder dyrene. d) En ferskvandstangloppe G. pulex, der æder bladmateriale.

Inden forsøget blev en større mængde visne bøgeblade tørret i to døgn ved 105 °C. Portioner af tørrede blade blev afvejet; til G. pulex og S. personatum blev hhv. 50 blade (4-5 g tørvægt) og 30 blade (2,5-3 g tørvægt) anvendt pr. rende. Bladportionerne blev konditioneret separat i 800 ml beluftet åvand i 7 dage ved 25 °C og konstant belysning med en 60 W glødepære.

I hver rende (længde: 2 m) blev 0,5 l grus (med kornstørrelserne 6-12 mm) fordelt, og seks større sten (diameter: 5-10 cm) blev placeret med ca. 25 cm afstand. De konditionerede bøgeblade blev udlagt under den opstrøms ende af disse større sten (Figur 2.2.1b), således at bladene var tilgængelige for dyrene i renden (Figur 2.2.1d).

Det var oprindelig hensigten at undersøge betydningen af interaktioner mellem forskellige arter af smådyr, når blandede populationer af disse blev udsat for modelpyrethroidet. Imidlertid viste de opgivne forsøg i de små render i Lemming (se overfor) ret tydeligt, at de udvalgte forsøgsdyr (G. pulex og vårfluerne C. villosa og S. personatum) blev påvirket i samme omfang ved 0,5 og 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹. Da det derfor vurderes lidet sandsynligt, at der ville forekomme væsentlige interaktioner mellem arterne, blev det besluttet kun at foretage forsøg med arterne hver for sig, samt kun at anvende den ene af de to vårfluearter (ikke mindst fordi det på det pågældende tidspunkt ikke var muligt at fremskaffe tilstrækkeligt med egnede forsøgsdyr af C. villosa). Til gengæld blev det besluttet at øge forsøgsperioden fra 7 til 14 dage for bedre at vurdere, om forsøgsdyrene var i stand til at komme sig.

Tre forsøg blev gennemført, heraf to med G. pulex (indsamlet i Lindved Å) og et med S. personatum (indsamlet i Rold Kilde). I det første forsøg med G. pulex var der en stor andel af små individer med mindre omsætningsrater tilfølge. Forsøget blev derfor gentaget med større individer, og kun resultaterne for dette andet forsøg er medtaget i nærværende rapport. I alt 30 forsøgspopulationer à enten 50 G. pulex eller 15 S. personatum blev anvendt i forsøgene, hvor 6 behandlinger blev undersøgt:

• en kontrolgruppe med ueksponerede dyr, tilbudt ukontaminerede bøgeblade
• tre grupper med dyr, der var blevet pulseksponeret i 90 min for henholdsvis 0,05, 0,5 og 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹, og derefter tilbudt ukontaminerede bøgeblade
• to grupper med ueksponerede dyr, der blev tilbudt bøgeblade, der forinden havde været eksponeret for henholdsvis 0,5 og 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹ i 90 minutter.

Ved hver behandling var n=5 (dvs. 5 ”ens” render).

Forsøgspopulationerne blev hver for sig akklimatiseret natten over i bægre i 800 ml beluftet, ukontamineret, kunstigt ferskvand, mens de konditionerede blade blot umiddelbart inden eksponeringen blev overført til bægre med 800 ml beluftet, ukontamineret kunstigt ferskvand. Ved eksponeringens start blev de ønskede mængder lambda-cyhalothrin opløst i 80 µl ethanol og tilsat bægrene. Kontrol-populationer og -blade fik blot tilsat 80 µl ethanol. Beluftningen sikrede en hurtig opblanding. Den anvendte koncentration af ethanol på 0,1 ‰ overstiger således ikke den vejledende grænse for opløsningsmidler (OECD 2000). Efter 90 minutters eksponering blev dyrene hældt gennem en te-si, og bladene gennem en større sigte, og skyllet grundigt tre på hinanden følgende gange i ukontamineret vand, hvorefter de blev overført til 800 ml beluftet, ukontamineret, kunstigt ferskvand. Dagen efter blev dyr og blade overført til de små strømrender. Forsøget blev afsluttet efter 14 dage, og for G. pulex blev dyrenes overlevelse bestemt. For S. personatum blev antallet af aktive individer blandt de genfundne dyr registreret. Aktivitetsniveauet hos S. personatum blev bedømt visuelt. Det var ikke muligt at afgøre, hvorvidt inaktive dyr var døde, da de naturligt kan trække sig ind i deres huse. Det tilbageværende bladmateriale blev indsamlet, tørret i to døgn ved 106 °C, og vejet, således at omsætningen af bladmaterialet kunne bestemmes. Restitueringsperiodens varighed blev valgt på baggrund af et pilotforsøg med G. pulex, se afsnit 2.2.2.

Endvidere blev et forsøg uden dyr, men med ueksponerede, konditionerede blade, gennemført for at bestemme bladenes vægttab i renderne, forårsaget af fysiske påvirkninger ved håndtering af bladene og det strømmende vand.

2.2.2 Restitueringsevne hos Gammarus pulex (pilotforsøg)

Forsøget blev gennemført i efteråret 2006 med henblik på at fastlægge forsøgsdesignet til efterfølgende studier af lambda-cyhalothrins effekt på smådyrs mobilitet og restitueringsevne. De indsamlede G. pulex (fra Lindved Å, Fyn) blev akklimatiseret natten over i glaspetriskåle (diameter: 9 cm) indeholdende 80 ml kunstigt ferskvand. Baggrundsadfærden hos fire grupper à 24 G. pulex blev registreret ved videosporing i 30 min i ukontamineret, kunstigt ferskvand. Dernæst blev videosporingen midlertidigt afbrudt, og lambda-cyhalothrin, opløst i ethanol + vand (20 ml), blev tilført tre grupper til nominelle koncentrationer på henholdsvis 0,01, 0,1 og 1 µg l^-¹. Kontrolgruppen fik tilført en tilsvarende mængde ethanol + vand. Det anvendte volumen på 20 ml vurderedes tilstrækkeligt til at sikre fuldstændig opblanding i petriskålene. Tilsætningen af væsken blev foretaget længst muligt fra dyrets position, og videosporingen blev genoptaget 2 minutter efter afbrydelsen. Dernæst blev kontrolgruppens og de eksponerede gruppers adfærd fulgt i endnu 90 minutter. Herefter blev videosporingen afbrudt, og alle 96 G. pulex blev overført til te-sier og skyllet skånsomt, men grundigt, i tre kar indeholdende ukontamineret, kunstigt ferskvand. Efterfølgende blev dyrene overført til rene, nummererede petriskåle indeholdende 100 ml ukontamineret vand, hvilket muliggjorde, at de enkelte individers adfærd kunne følges i indtil tre uger efter endt eksponering. Bevægelsesadfærden blev registreret på dag 1, 2, 3, 6, 9, 14 og 20 efter endt eksponering ved at videospore dyrene i 60 min. Dødeligheden blev ligeledes registreret på videosporingsdagene med henblik på at kortlægge overlevelsen.

2.2.3 Restitueringsevne og fødesøgning hos udvalgte iturivere

Fire forsøg med iturivere, henholdsvis L. nigra (indsamlet i et unavngivet skovvandløb i Velling Skov), G. pulex (indsamlet i Lindved Å, Fyn), S. personatum (indsamlet i Rold Kilde) og C. villosa (indsamlet i Travnskov Bæk, Fyn), blev gennemført i 2007. For hver art blev 7 behandlinger undersøgt, med n=14-15 individer i hver gruppe. Individerne blev holdt fuldstændigt adskilt i separate plastarenaer. Hos L. nigra var der imidlertid stor dødelighed samtidig med, at det blev observeret, at den individuelle omsætningsrate af bladmateriale var for lille til at kunne bestemmes med tilstrækkelig præcision. I nærværende rapport er kun resultater for G. pulex, S. personatum og C. villosa derfor medtaget.

De 7 behandlinger var:

• en kontrolgruppe med ueksponerede dyr (n=15), tilbudt ukontaminerede, konditionerede bøgeblade
• fire grupper med dyr (n=14), der blev pulseksponeret i 90 min for henholdsvis 0,005, 0,05, 0,5 og 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹, og derefter tilbudt ukontaminerede, konditionerede bøgeblade
• to grupper med ueksponerede dyr (n=14), der blev tilbudt konditionerede bøgeblade, der forinden havde været eksponeret for henholdsvis 0,5 og 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹ i 90 minutter.

Inden forsøget blev en større mængde visne bøgeblade tørret i to døgn ved 105 °C. Herefter blev bladene konditioneret i beluftet åvand i 7 dage ved 25 °C. Midt i konditionerings-perioden blev disse blade klippet i fire stykker. Dette skete for at sikre dyrene et varieret fødeudbud, idet hvert individ blev tilbudt fire mindre bladstykker, som ikke stammede fra samme konditionerede blad.

Dagen inden eksponeringen blev dyrene overført til individuelle plastarenaer indeholdende 70 ml kunstigt ferskvand, og der blev taget billeder af dyrene til senere bestemmelse af størrelse (G. pulex: kropslængde, S. personatum og C. villosa: længde af hus) ved hjælp af ImageJ (National Institute of Health). Dyrene blev derefter akklimatiseret natten over.

På eksponeringsdagen (dag 0) blev dyrenes baggrundsadfærd i ukontamineret vand indledningsvis registreret over 60 min. Herefter blev videosporingen midlertidigt afbrudt, og lambda-cyhalothrin, opløst først i ethanol og dernæst i kunstigt ferskvand til et samlet volumen på 10 ml, blev tilsat. Kontrolgruppen fik tilsat en tilsvarende mængde ethanol opløst i vand. Det anvendte volumen på 10 ml sikrede en fuldstændigt opblanding af vandet i arenaen. Den anvendte koncentration af ethanol på 0,1 ‰ overstiger ikke den vejledende grænse for opløsningsmidler (OECD 2000). Tilsætningen blev foretaget længst muligt fra dyrenes position i petriskålene, og videosporingen blev genoptaget 2 min. efter afbrydelsen. Dyrenes bevægelsesadfærd blev herefter fulgt over 90 min, hvorefter videosporingen blev afbrudt. Dyrene blev forsigtigt hældt gennem en te-si og forsigtigt, men grundigt, skyllet tre på hinanden følgende gange i kunstigt ferskvand, hvorefter dyrene blev overført til nye arenaer med ukontamineret, kunstigt ferskvand. Dyrene opholdt sig i disse arenaer under resten af forsøget, og vandet blev fornyet efter behov. I forsøgene, hvor kun bladene blev kontamineret med pesticid, blev bladstykkerne eksponeret i 1-liters plastakvarier i beluftet, kunstigt ferskvand tilsat lambda-cyhalothrin opløst i ethanol, mens kontrolbladstykkerne kun fik tilsat ethanol (slutkoncentration af ethanol = 0,1 ‰). Efter endt eksponering blev bladstykkerne skyllet tre på hinanden følgende gange i baljer med hanevand, hvorefter de blev overført til beluftet, ukontamineret, kunstigt ferskvand, inden de dagen efter (dag 1) blev givet til dyrene (Figur 2.2.2). Den samlede vådvægt af de fire bladstykker givet til hvert dyr blev bestemt.

Figur 2.2.2. Den eksperimentelle enhed: plast-arena indeholdende ét individ af S. personatum og 4 konditionerede bladstykker.

Dyrenes fødesøgning blev fulgt over en 14-dages restituerings-periode efter endt eksponering. For G. pulex blev dyrenes overlevelse bestemt dagligt i perioden, og døde dyr blev fjernet. For C. villosa og S. personatum blev antallet af aktive individer registreret dagligt. Aktivitetsniveauet hos vårfluerne blev bedømt visuelt, idet det var ikke muligt at afgøre, hvorvidt inaktive dyr var døde, da de naturligt kan trække sig ind i deres huse.

På dag 1, 2, 4, 7, 10 og 14 blev bladstykkerne vejet (vådvægt), og dyrenes bevægelsesadfærd i en 60 min periode blev registreret. Restitueringsperiodens varighed blev valgt på baggrund af pilotforsøget med G. pulex (se afsnit 2.2.1).

Sideløbende med forsøgene blev baggrundsvægttabet af bladene bestemt i arenaer uden dyr, idet 7 arenaer med ukontaminerede blade, 7 arenaer med blade eksponeret for 0,5 µg l^-¹ og 7 arenaer med blade eksponeret for 5,0 µg l^-¹ blev behandlet efter samme procedure som angivet for forsøgene med dyr.

2.2.4 Overlevelse og fødesøgning hos græsseren Heptagenia sulphurea

Effekten af lambda-cyhalothrin på døgnfluen Heptagenia sulphurea (indsamlet i Sallinge Å, Fyn), der lever af at græsse mikroalger på sten, blev undersøgt i et forsøg, der designmæssigt adskilte sig fra forsøgene med ituriverne. Fokus var således udelukkende på overlevelse og fødeomsætning, idet dyrenes bevægelsesadfærd og restituering blev ikke kvantificeret. I dette forsøg bestod føden af algefilm på fliser. Som i forsøgene med iturivere blev såvel pyrethroid-eksponerede dyrs græsning af ukontaminerede mikroalger, som ueksponerede dyrs græsning af pyrethroid-kontaminerede mikroalger undersøgt.

De anvendte fliser havde en ru overflade for at sikre, at mikroalgerne kunne fæstne sig ligesom på naturlige sten. Fliserne blev tilpasset i størrelse og havde et gennemsnitligt areal på 54 cm². Inden forsøgets start blev fliserne konditioneret i 18 dage sammen med algebegroede sten og åvand hentet i Sallinge Å. Konditioneringen foregik i 10-liters akvarier, hver indeholdende 4-5 fliser og 3-5 algebegroede sten i 8 l beluftet åvand, ved 14-15 °C, og under en vækstlampe med en døgnrytme med 12 timers lys og 12 timers mørke (Figur 2.2.3). I konditioneringsperioden blev fliserne to gange ugentligt flyttet rundt mellem akvarierne. Dette skete for at sikre ensartede betingelser for mikroalgerne, da f.eks. lysintensiteten kunne tænkes at variere mellem akvarierne i forsøgsopstillingen. Fordampningen fra akvarierne nødvendiggjorde, at der flere gange blev tilført ekstra åvand.

Figur 2.2.3. Konditionering af fliser (gennemsnitligt areal på 54 cm²) foregik over 18 dage i 10-liters akvarier, hver indeholdende 4-5 fliser og 3-5 algebegroede sten i 8 l beluftet åvand, ved 14-15 °C, under en vækstlampe med en døgnrytme med 12 timers lys og 12 timers mørke.

Den eksperimentelle enhed under selve forsøget var et 1-liters plast-akvarium indeholdende 1 konditioneret flise med eller uden 11 individer af H. sulphurea (Figur 2.2.4). Der blev således anvendt en relativt høj – men ikke unaturlig høj - tæthed af forsøgsdyr. I alt blev 660 H. sulphurea og 74 fliser anvendt. 74 akvarier blev delt op i 8 behandlingsgrupper:

• en kontrolgruppe med 10 akvarier (n=10), hver med 11 ueksponerede dyr og én ukontamineret, algebegroet flise
• tre grupper à 10 akvarier (n=10), hver med 11 dyr, der var blevet pulseksponeret i 90 min for henholdsvis 0,05, 0,5 og 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹, og derefter tilbudt én ukontamineret, algebegroet flise
• to grupper à 10 akvarier (n=10), hver med 11 ueksponerede dyr, der blev tilbudt én algebegroet flise, der forinden havde været eksponeret for enten 0,5 og 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹ i 90 minutter
• to grupper à 7 akvarier (n=7), hver med én algebegroet flise, men uden dyr. I den ene gruppe var fliserne ukontaminerede, mens de i den anden gruppe havde været eksponeret for 5 µg lambda-cyhalothrin l^-¹ i 90 minutter. Dette blev gjort for at undersøge, hvorvidt lambda-cyhalothrin kunne påvirke algevæksten.

Flisernes størrelse var tilpasset 1-liters akvarierne således, at de dækkede ca. ¾ dele af bunden. Dyrene havde dermed mulighed for at fjerne sig fra fliserne.

Figur 2.2.4. Den eksperimentelle enhed: 1-liters plast-akvarium indeholdende 1 konditioneret flise og 11 H. sulphurea.

Dagen inden eksponeringen blev de 660 individer af H. sulphurea fordelt i 60 eksponeringsakvarier indeholdende 200 ml åvand, og akklimatiseret natten over. Dyrene blev fordelt tilfældigt, og der var ingen tydelig forskel i størrelsesfordelingen mellem grupperne. Fliserne blev eksponeret i 500 ml åvand. Såvel eksponeringen af dyrene som mikroalgerne på fliserne blev således gennemført i åvand og ikke i kunstigt ferskvand, som i forsøgene med de øvrige arter. Dette blev gjort for at mindske risikoen for at ødelægge mikroalgefilmen på fliserne. Eksponeringen af fliserne blev gennemført umiddelbart inden eksponeringen af dyrene. Pulseksponeringens varighed var 90 min, og ved eksponeringens start blev de ønskede mængder lambda-cyhalothrin opløst i ethanol tilsat bægrene. Kontrolpopulationer og -fliser fik blot tilsat ethanol. Grundig omrøring sikrede en hurtig opblanding. Den anvendte koncentration af ethanol på 0,1 ‰ oversteg ikke den vejledende grænse for opløsningsmidler (OECD 2000). Efter endt eksponering blev fliserne skyllet 3 på hinanden følgende gange i baljer med åvand, hvorefter de blev overført til forsøgsakvarierne. Døgnfluerne blev forsigtigt hældt op i en te-si og meget forsigtigt, men grundigt, skyllet tre på hinanden følgende gange ved neddypning i beholdere med åvand, hvorefter dyrene forsigtigt blev overført til forsøgsakvarierne med fliserne. Alle akvarier fik tilført 500 ml åvand, hentet fra Sallinge å, og hvert akvarium blev beluftet grundigt via luftsten. Døde dyr og skiftede huder blev dagligt fjernet fra flisernes overflade for at forhindre øget algevækst som følge af næringsstoffrigivelse fra forrådnende animalsk materiale.

Forsøget blev afsluttet efter 7 dage, og dyrenes overlevelse blev bestemt. Fliserne blev overført til rene 1-liters akvarier, hvor de blev lagt på papirclips med oversiden nedad. Herefter blev 50 ml ethanol tilsat, hvilket var nok til at dække fliserne, og akvarierne blev placeret i mørke plastikposer til ekstraktion i 6 timer ved stuetemperatur. Efter ekstraktionen blev fliserne fjernet, og volumen af den tilbageværende klorofylholdige ethanol blev bestemt. Fordampningen af ethanol i akvarierne var ikke ensartet, og ethanol blev tilsat, således at alle ekstrakter havde et totalvolumen på 50 ml. Herefter blev en prøve fra hvert ekstrakt overført til et Eppendorfrør, centrifugeret ved 3000 rpm i 5 min, og overført til kuvetter, således at absorbansen kunne måles spektrofotometrisk. Prøverne blev målt ved 750 nm og ved klorofyl a’s absorptionsmaksimum ved 665 nm. Klorofyl a indholdet i ekstrakterne blev bestemt ud fra differencen mellem absorbanserne ved 665 og 750 nm, idet ethanol blev anvendt som reference (Dansk Standard 1986). Den arealspecifikke mængde af klorofyl a, bestemt som mg m^-², blevet anvendt som mål for algebiomassen på fliserne.

2.3 Langdistance-kolonisering hos smådyr i fynske vandløb

I denne del af projektet blev data fra fynske vandløb analyseret ”biogeografisk” (jf. Nathan et al., 2003). Disse vandløb repræsenterer således fuldskala ”forsøgsomstændigheder”, der er velegnede til at følge lang-distance-spredning og kolonisering hos vandløbenes smådyr over tid. Således var disse vandløb gennem det meste af perioden 1955-1985 udsat for betydende forureninger i form af dels mange udledninger af urenset eller meget utilstrækkeligt renset spildevand fra bysamfund, mejerier og slagterier, dels periodiske, men oftest meget kraftige (og i øvrigt ulovlige) udledninger af ajle, møddingsvand og ensilagesaft fra landbrugsejendomme. Det betød, at der kun ganske få steder - og kun i enkelte vandsystemer - fandtes stort set upåvirkede samfund af smådyr med forekomst af udprægede rentvandskrævende arter. Efter den nævnte periode blev vandkvaliteten imidlertid afgørende forbedret ved udbygning af de kommunale renseanlæg og effektivt stop for landbrugets ulovlige udledninger. Den afgørende forbedring (målt som lavt indhold af BOD₅ og ammonium) slog i de større vandløb igennem omkring 1990 (Fyns Amt 2003); scenen var derfor sat for en mulig genindvandring til et stort antal vandløb og vandløbssystemer

Fyns Amt har siden midten af 1980’erne og frem til og med 2006 (hvor amterne blev nedlagt) årligt undersøgt faunaen ved de samme ca. 900 vandløbsstationer. Data herfra repræsenterer en - på landplan helt unik - 21 år lang tidsserie. Disse data er lagret i en database indeholdende mere end 19.000 prøver. Det giver mulighed for nøje at følge indvandringen af visse arter af rentvandskrævende smådyr til vandløbssystemer, hvorfra de ikke førhen var kendt, men hvor vandkvaliteten var blevet afgørende forbedret.

Beregning af enkelte arters koloniseringsafstande over land og den tid, det tog, før koloniseringen fandt sted, bygger imidlertid på nogle antagelser og forudsætninger. Først og fremmest skal der være en rimelig sikkerhed for, at hvis en art blev fundet inden for et givet vandsystem, hvori den ikke tidligere var registreret, var der tale om reel indvandring. Der skal altså være sikkerhed for, at arten ikke allerede findes inden for det pågældende vandsystem, hvor den i givet fald har levet ubemærket af undersøgelserne. Det udelukker langt de fleste arter, som er knyttet til de mindste vandløb og kilder, fordi disse habitater ikke var tilstrækkelig dækket af det anvendte net af moniteringsstationer. Det betyder, at kandidater for analysen af spredning mellem vandsystemer skal søges blandt de arter, som er knyttet til mellemstore og store vandløb, og som ikke findes i de små bække og kilder. Disse større vandløb vurderes desuden at være tilstrækkelig dækket af nettet af overvågningsstationer. Det forudsættes endvidere, at kolonisering af et ”nyt vandløbssystem” er sket fra det nærmest beliggende kendte levested. Denne antagelse er givetvis ikke altid rigtig, hvilket betyder, at arternes spredningsevne i det mindste ikke overvurderes. Endelig kræves nogle tidslige antagelser. Generelt betragtes de større vandløb vandkvalitetsmæssigt som egnede levesteder fra 1990, hvor disse vandløbs BOD₅ indhold (som gennemsnit) nåede under 2 mg l^-¹ (Fyns Amt 2003). Det betyder, at hvis en art for første gang optræder i et vandsystem i fx 1996, og hvis det forudsættes, at den er kommet fra en lokalitet, hvor den har levet siden fx 1980 (og formodentligt lang tid tidligere), sættes ”nulpunktet” for beregning af koloniseringstiden til 1990. Derudover er der i specifikke tilfælde sat ”nulpunkt” ved tidspunktet for udbygning af et specifikt offentligt renseanlæg (eller afskæring af spildevandet), hvorved vandkvaliteten er blevet tilstrækkelig forbedret til, at indvandrende arter kan overleve. Hvis spredning derimod er foregået mellem to vandsystemer, der begge først har fået en bestand af arten efter 1990, foretages der ingen korrektion af ”nulpunktet”. Grænsen på 2 mg BOD₅ l^-¹ for tilstedeværelse eller fravær af de udvalgte arter af smådyr er i øvrigt primært baseret på resultater, som er publiceret af (Friberg et al. 2009).

Koloniseringsafstanden mellem to lokaliteter er beregnet ved den korteste afstand ved brug af GIS. Herudover er spredningsretningen kategoriseret som hhv. vestlig (V), nordlig (N), østlig (Ø) eller sydlig (S) (samt som NV, NØ, SØ og SV). Endelig er ved brug af GIS beregnet, hvor stor en del af koloniseringsafstanden, der er dækket af hhv. skov, bymæssig bebyggelse, eller landbrugsland (dvs. resten).

Supplerende blev den generelle udvikling i udbredelsen af udvalgte smådyr analyseret. En overvejende del af denne udvikling skyldes spredning/kolonisering inden for det enkelte vandsystem, bl.a. via nedstrøms drift eller opstrøms vandring. Det forventes imidlertid, at mønsteret i udvikling også kan give et vist fingerpeg af omfanget af spredning over land mellem vandsystemer. Til at belyse dette er valgt 20 forskellige taxa af smådyr (dvs. arter/slægter eller mere overordnede grupper, se boks 2.1), der alle er relativt talrigt forekommende i de fynske vandløb, og som alle a priori kan betragtes som relativt rentvandskrævende. De kan derfor betragtes som indikatorer for forbedret vandkvalitet. Fire taxa er ikke-insekter, der ved egen hjælp udelukkende kan spredes inden for det samme vandløbssystem. En enkelt taxa – ferskvandssvampe – kan alene ved egen hjælp spredes i nedstrøms retning. Blandt insekterne (4 døgnfluearter, 2 slørvingerarter, 2 billearter, og 8 vårfluetaxa) er samtlige taxa i stand til at spredes over land – dvs. mellem vandsystemer – på et eller andet tidspunkt under deres voksenstadium.

Til støtte for de fundne koloniseringsafstande ud fra af data fra de fynske vandløb blev der foretaget sammenstillinger af danske og udenlandske data fra fangst af voksne insekter i lysfælder og Malaisefælder (sidstnævnte er et slags telt af fintmasket net, hvori insekterne fanges uden først at blive tiltrukket, således som det er tilfældet med lysfælder). Ud fra disse data kunne der ofte beregnes afstande til nærmeste kendte larveforekomst (se fx Wiberg-Larsen & Karsholt 1999). Desuden er der foretaget et omfattende litteratursøgning efter relevante oplysninger om lang-distance spredning hos ferskvandssmådyr – og de faktorer som påvirker deres spredning - ikke bare fra vandløb, men også fra søer og damme. Det samlede resultatet af dette litteratur review er præsenteret i Bilag 4.

2.4 Statistiske Metoder

2.4.1 Betydning af økosystemstruktur og –funktion for rekolonisering efter pyrethroidpåvirkning

Vægttab fra bladpakker og klorofylkoncentrationer i gruskopper i de 9 midtjyske vandløb blev evalueret ved to-vejs ANOVA, med eksponeringskoncentration og tid efter eksponering som de to faktorer. I en separat en-vejs ANOVA blev bladvægttabet og klorofylkoncentration i prøver udtaget umiddelbart inden eksponeringen (Før-prøver, dag 0) sammenlignet med prøver fra de tre eksponeringsgrupper udtaget umiddelbart efter eksponeringen (dag 0). Det blev gjort for at evaluere betydningen af selve håndteringen. De samlede resultater for vægttab fra bladpakkerne blev endvidere evalueret ved ANCOVA, med eksponeringskoncentration som kategorisk faktor og tid efter eksponering som kontinuert kovariat, med henblik på at sammenligne de lineære regressionsligninger for vægttabet over tid. I de tilfælde, hvor post hoc multiple parvise sammenligninger blev foretaget, blev Bonferroni-korrektion anvendt.

Vægttab fra bladpakker i de store strømrender i Lemming blev evalueret ved tre-vejs ANOVA, med eksponeringskoncentration, tid efter eksponering og strømrendesektion (opstrøms/nedstrøms) som de tre faktorer. Resultaterne blev desuden evalueret ved ANCOVA, med strømrendesektion (kontrol-opstrøms, kontrol-nedstrøms, eksponeret-opstrøms og eksponeret-nedstrøms) som kategorisk faktor og tid efter eksponering som kontinuert kovariat, med henblik på at sammenligne de lineære regressionsligninger for vægttabet over tid. I de tilfælde, hvor post hoc multiple parvise sammenligninger blev foretaget, blev Bonferroni-korrektion anvendt.

Smådyrsfauna i bladpakker og surberprøver i de store strømrender i Lemming: Supplerende tre-vejs ANOVA’er blev udført for det totale antal taxa og det totale antal individer i såvel bladpakker som surberprøver med eksponeringskoncentration, tid efter eksponering og strømrendesektion (opstrøms/nedstrøms) som de tre faktorer. Data for det totale antal individer i surberprøverne blev log-transformerede (x’=log(x+1)) for at opfylde krav om normalitet og varianshomogenitet. En sekventiel Bonferroni-korrektion (Bonferroni-Holm) blev anvendt til a priori multiple parvise sammenligninger.

Vægttab fra, og hyppighed af Gammarus pulex i, bladpakker fra Stavis Å:

Resultater for vægttab i bladpakkerne fra Stavis Å blev evalueret ved to-vejs ANOVA, med eksponeringskoncentration og tid efter eksponering som de to faktorer. Resultaterne blev desuden evalueret ved ANCOVA, med eksponeringskoncentration som kategorisk faktor og tid efter eksponering som kontinuert covariat. Data for antallet af Gammarus pulex i bladpakkerne blev evalueret ved to-vejs ANOVA med eksponeringskoncentration og tid efter eksponering som faktorer. En sekventiel Bonferroni-korrektion (Bonferroni-Holm) blev anvendt til a priori multiple parvise sammenligninger.

Alle de ovenfor nævnte statistiske tests blev udført ved hjælp af SAS^® (version 9.1 for Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), og i alle tilfælde blev et signifikansniveau på α=0,05 anvendt.

Forskelle i taxonsammensætning mellem prøverne fra hhv. de midtjyske vandløb, de store render i Lemming og Stavis Å blev analyseret ved brug af såkaldt MultiDimensionel Scaling af similariteter. Princippet er, at der for alle parvise kombinationer af prøverne beregnes et similaritetsindeks. For de kvantitative prøver blev typisk anvendt Bray-Curtis similaritetsindeks. De mange beregnede indeks-værdier ordineres derefter i et multidimesionelt rum ved en form for regression. De to bedst forklarende regressioner, der er de to første akser i et n-dimensionelt koordinatsystem, blev afbildet. Der beregnes en såkaldt stressværdi for ordinationen, der udtrykker, hvor godt de to akser beskriver den samlede variation i indeksværdierne. Stressværdien skal her være så lille så mulig. I selve ordinationen er de enkelte prøver placeret således, at de som ligner hinanden mest, ligger tættest ved hinanden, mens meget forskellige prøver ligger langt fra hinanden. Inden der blev beregnet similariteter, blev data log(x+1) transformeret for at ”nedvægte” dominerende taxa (således at mindre individrige taxa fik relativt større betydning end uden transformeringen). Statistisk signifikante forskelle mellem prøverne i de udførte ordinationer blev analyseret ved brug ANOSIM. Kun p-værdier < 0,05 blev betragtet som signifikante. Prøver blev vurderet som klart adskilte, hvis den beregnede statistiske værdi R var >0,75, for vel adskilte, hvis R var >0,50, og knapt adskilte for R>0,25. Til beregningerne og analyserne blev anvendt PRIMER version 5 (PRIMER-E 2000). Metoden er i øvrigt nærmere beskrevet af Clarke & Warwick (1994) og Clarke & Gorley (2001).

Forskelle i tab af smådyr fra hhv. ubehandlede og behandlede substrater under eksponeringen mv. af disse blev analyseret med t-test efter log-transformering af data (x’=log(x+1)) for at opfylde krav om normalitet og varianshomogenitet. Testene blev udført med programmet XLSTAT, version 5.1, Addinsoft. Der blev i alle tilfælde anvendt et signifikansniveau på α=0,05.

Øvrige tests:

Der blev derudover udført en række mere simple tests, fx af forskelle i artssammensætning mellem sparkeprøver og driftprøver. Disse blev typisk udført non-parametrisk og med programmet XLSTAT, version 5.1, Addinsoft. Der blev i alle tilfælde anvendt et signifikansniveau på α=0,05.

2.4.2 Pyrethroideffekt på smådyrs mobilitet, evne til restituering, samt substrat- og fødekvalitet

Raterne for omsætning af blade i de små strømrender blev evalueret ved en-vejs ANOVA efterfulgt af post hoc multiple parvise sammenligninger med Bonferroni-korrektion. Et signifikansniveau på α=0,05 blev anvendt.

Pilotforsøg - Restitueringsevne hos Gammarus pulex:

Bevægelsesadfærden på forsøgets første dag (dag 0, kontrol- og eksponeringsperioden) blev evalueret med to-vejs repeated measures ANOVA. Kontrolperioden og eksponeringsperioden blev analyseret separat for at sammenligne henholdsvis gruppers baggrundsadfærd og eventuelle adfærdsændringer under eksponering. Grupperne blev efterfølgende sammenlignet parvis med repeated measures ANOVA.Videosporingsdata fra tre gruppers (kontrolgruppen samt grupperne eksponeret for 0,01 og 0,1 µg l^-¹) restitueringsperiode blev sammen med data fra kontrolperioden på dag 0 evalueret med en to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni-korrigeret Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test. Repeated measures blev ikke anvendt, da der, som forventet, blev observeret en koncentrationsafhængig dødelighed under restitueringen. Dette var særlig markant for gruppen eksponeret for 1 µg l^-¹. For denne gruppe var det kun muligt at opnå videosporingsdata for dag 0 og 1 for et tilstrækkeligt stort antal individer, da der herefter kun var få overlevende. Derfor blev endnu en to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni-korrigeret Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test anvendt til at sammenligne de fire grupper på disse to dage. Ved afvigelse fra normalitet og varianshomogenitet blev data transformeret, enten logaritmisk (x’=log(x+1)) eller ved en kvadratrodstransformation (X’=(X+3/8)^1/2), for at opfylde disse krav (Zar 1984). ANOVA-analyserne blev foretaget ved hjælp af SAS (version 9.1 for Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Overlevelseskurverne fra restitueringsperioden blev fittet ved nonlineær regressionsanalyse. Et antal regressionsligninger blev evalueret, og det bedste fit blev opnået med ligningen y=ae^-bt + ce^-dt. I alle tilfælde blev signifikante regressioner opnået. Regressionsanalysen blev udført med Sigmaplot (version 7.101, SPSS Inc., Chicago, USA). I alle statistiske analyser blev et signifikansniveau på α=0,05 anvendt.

Restitueringsevne og fødesøgning hos udvalgte iturivere:

Data for bevægelsesadfærd blev i alle tilfælde log-transformeret (x’=log(x+1)) for at opfylde krav om normalitet og varianshomogenitet (Zar, 1984). Data fra eksponeringsdagen blev analyseret ved hjælp af to-vejs repeated measures ANOVA. Her blev de fire grupper sammenlignet dels i kontrolperioden, for at sammenligne baggrundsadfærden, og dels i eksponeringsperioden, for at evaluere eventuelle adfærdsændringer under eksponering. Ved en signifikant interaktion mellem faktorerne tid og behandling blev der lavet parvise sammenligninger af grupperne, ved hjælp af Bonferroni-korrigerede to-vejs repeated measures ANOVA'er. Restitueringsadfærden blev, sammen med data fra kontrolperioden på dag 0, analyseret ved hjælp af to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni-korrigeret Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test. Repeated measures blev ikke anvendt, da der, som forventet, blev observeret en koncentrationsafhængig dødelighed/inaktivering under restitueringen. For G. pulex og S. personatum var der ikke data for alle grupper til alle tidspunkter, og ANOVA-analysen blev derfor udført på et reduceret datasæt. Raterne for omsætningen af bladmateriale hos de tre arter blev log-transformeret (x’=log(x+1)) for at opfylde krav om normalitet og varianshomogenitet (Zar, 1984). Data blev evalueret ved to-vejs repeated measures ANOVA efterfulgt af en Bonferroni-korrigeret Fisher’s Least Significant Difference (LSD) test. Rater for massetabene i grupperne af blade uden dyr blev evalueret ved en 1-vejs ANOVA. Størrelsen af de anvendte individer blev sammenlignet ved hjælp af en-vejs ANOVA. Alle statistiske tests blev udført v.hj.a SAS^® (version 9.1 for Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), og i alle tilfælde blev et signifikansniveau på α=0,05 anvendt.

Overlevelse og fødesøgning hos græsseren Heptagenia sulphurea:

Data for algebiomasse blev analyseret ved 1-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni-korrigeret Fisher’s LSD (Least Significant Differences) test, idet data blev log-transformeret (x’=log(x+1)) for at opfylde krav om normalitet og varianshomogenitet (Zar, 1984). For algebiomassen blev det a priori besluttet kun at lave parvise sammenligninger i forhold til henholdsvis kontrolgruppen og gruppen af ukontaminerede fliser uden dyr. Overlevelsesdata kunne ikke transformeres med henblik på opfyldelse af krav om normalitet og varianshomogenitet, og blev derfor analyseret ved en non-parametrisk 1-vejs ANOVA, Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Bonferroni-korrigerede parvise Mann-Whitney tests. Her var det a priori besluttet kun at lave parvise sammenligninger i forhold til kontrolgruppen. Alle statistiske tests blev udført v.hj.a SAS^® (version 9.1 for Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), og i alle tilfælde blev et signifikansniveau på α=0,05 anvendt.

2.4.3 Langdistance-kolonisering hos smådyr i fynske vandløb

Den tidlige udvikling i udbredelsen af udvalgte makroinvertebrater blev søgt beskrevet ved hhv. lineær eller exponentiel kurvefit. Disse kurver samt sammenhænge mellem koloniserede afstande og tiden medgået til kolonisering blev evalueret v.hj.a. programmet XLSTAT, version 5.1, Addinsoft. Der blev i alle tilfælde anvendt et signifikansniveau på α=0,05.

2.5 Kvantificering af lambda-cyhalothrin

For at opnå realistiske koncentrations-respons-sammenhænge mellem pyrethroidkoncentration og indvirkning på bevægelses- og driftadfærd er de reelle koncentrationer af lambda-cyhalothrin blevet bestemt i såvel laboratorie- som strømrendeeksponeringssystemerne. Metoden er udviklet i et tidligere pesticidforskningsprojekt (Nørum et al. 2006). Metodens princip er baseret på fastfaseekstraktion af pesticidkontamineret ferskvand efterfulgt af opkoncentrering ved inddampning, samt kvantificering ved omvendt fase HPLC-MS. Metoden er baseret på vandprøver med et volumen på 100-1000 ml.

2.5.1 Forbehandling af vandprøver

Umiddelbart efter opsamling af afmålt vandprøve indeholdende lamdba-cyhalothrin tilsættes en kendt mængde intern standard (esfenvalerat).

2.5.2 Fastfaseekstraktion

Ekstraktion af lambda-cyhalothrin fra vandprøven foretages på en C18-søjle (Sep Pak Vac, 6 cc, 1 g, C18 cartridges, fra Waters). Søjlen konditioneres med 5 ml methanol og vaskes med 5 ml Milli-Q vand. Prøven påsættes søjlen ved 20 kPa vacuum, svarende til ca. 3 ml/min. Dernæst vaskes søjlen med 5 ml Milli-Q vand og tørres i 1-2 minutter ved 30-40 kPa vacuum. Pesticidet elueres med 4 ml methanol. Eluatet inddampes efterfølgende til tørhed under luftstrøm og genopløses i 0,300 ml 75% methanol.

2.5.3 LC-MS analyse

Det anvendte Hewlett Packard LC-MSD-system består af en HP Series 1100 HPLC (solvent degasser, binær pumpe, autosampler og termostatreguleret kolonneafdeling) og et G1946A MSD quadropole massespektrometer udstyret med electrospray ionisation (ESI) i positiv mode. Til kvantificeringen anvendes en HPLC-kolonne (C18, 150×2,1 mm, Phenomenex fra Subware) med forkolonne af samme materiale. Der anvendes et væskeflow på 0,4 ml/min, en injection af 50 µl prøve, og en kolonnetemperatur på 25 °C. Følgende LC solventer blev brugt: Eluent A: 10 mM ammoniumacetat:methanol, 990:10 (v:v). Eluent B: 10 mM ammoniumacetat:methanol, 10:90 (v:v). Der elueres med følgende gradient (Tid,% B): (0 min, 75%); (3 min, 100%); (14 min, 100%); (14,1 min, 75%); postrun-tid: 6 min, 25% B. Massespektrometer-opsætning: Mode: ESI positiv (SIM: m/z 467 for lambda-cyhalothrin). Der benyttes intern standardisering med esfenvalerat (SIM: m/z 437). Drying gas temperature: 350 °C. Drying gas flow: 10 l/min. Nebulizer pressure: 30 psig. Capillary voltage: 3500 V. Fragmentor: 50 V. Standardkurven beregnes udfra standarderne: 0,7; 3,5; 35,0; 70,0 og 350 ng/ml injiceret standard. Lambda-cyhalothrin og esfenvalerat elueres efter henholdsvis 7,4 min og 8,0 min.

2.5.4 Lambda-cyhalothrin-koncentrationer

Nominelle og aktuelle koncentrationer af lambda-cyhalothrin i de udførte forsøg er angivet i tabel 2.2. Den gennemsnitlige genfinding var henholdsvis 53, 35, 31 og 32% i forsøgene i naturlige vandløb, store strømrender, små strømrender og de øvrige laboratorieforsøg. Et tab af stof fra vandfasen var forventelig bl.a. på grund af adsorption til forsøgsopstillingerne, hvilket skyldes lambda-cyhalothrins fysisk-kemiske egenskaber. Ved eksponering af bladene observeredes en yderligere reduktion i genfindingen, der i gennemsnit var 21% ved 0,5 µg l^-¹ og blot 6% ved 5 µg l^-¹. Dette viser, at en stor andel af pyrethroidet blev adsorberet til bladmaterialet, hvilket var hensigten med eksponeringen af føden. I resultatafsnittet angives de nominelle koncentrationer i tekst, tabeller og figurer.

Tabel 2.2. Nominelle og aktuelle koncentrationer i udførte forsøg. Da genfindingen af lambda-cyhalothrin i forsøg af samme type var meget ens, er gennemsnit ± sem angivet. Eksponeringen af blade til de forskellige forsøg blev foretaget efter samme protokol, og disse data er præsenteret samlet.

id: ikke detekteret

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Juli 2009, © Miljøstyrelsen.