Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø

7 Gliocladium roseum præparaters bekæmpelsesaktivtet i Pythium ultimum bioassay

7 Gliocladium roseum præparaters bekæmpelsesaktivitet i Pythium ultimum bioassay
7.1 Materialer og metoder
7.2 Resultater
7.3 Diskussion

Den plantepatogene svamp Pythium ultimum er udbredt over det meste af verden. Svampen findes mest i dyrkede jorde, hvor den lever saprofytisk på planterester eller nær planterødder i de øverste jordlag. Patogenet angriber en lang række plantearter, heriblandt en vigtig landbrugsafgrøde som bederoer og økonomisk vigtige væksthusafgrøder som eksempelvis agurk og salat. Desuden volder patogenet ofte alvorlige problemer i produktionen af potteplanter (Domsch et al., 1980). De største skader forekommer på frø og fremspirede planter og erkendes ved dårlig fremspiring og/eller kimplanter der dør (rodbrand). Ældre planter er generelt mindre følsomme overfor angreb, men da fysiologisk unge roddele på ældre planter er modtagelige, kan Pythium anrette store skader i eksempelvis etablerede potteplante-kulturer.

I litteraturen findes adskillige eksempler på bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning af frø med antagonister. Herunder bekæmpelse af rodbrand i agurk med T. harzianum (Taylor et al., 1991; Cliquet & Scheffer, 1996) og bekæmpelse af rodbrand på karse og bederoe med mykoparasitten P. oligandrum (McQuilken et al., 1990). Der er derimod ikke i litteraturen fundet eksempler på bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning med G. roseum. Der er derfor igangsat indledende undersøgelser af IK726's biologiske bekæmpelsespotentiale overfor Pythium

Formål

Formålet med nærværende forsøg er at undersøge om bejdsning af sukkerroefrø med G. roseum (IK726) kan bekæmpe jordbårent inokulum af P. ultimum under kontrollerede betingelser i klimakammerforsøg.

7.1 Materialer og metoder

Til undersøgelse af effekten af G. roseum bejdsning på Pythium angreb på kimplanter af sukkerroe (Beta vulgaris ssp. vulgaris) benyttes et bioassay, hvor inokulum af patogenet iblandes vækstmediet. Assayet er modificeret efter Larsen (1996).

Bejdsning af frø

Roesorten "Magnat" (Danisco Seed) anvendes i alle forsøgene. Frøene overflade desinficeres i 0.5% NaOCl (10 min.) efterfulgt af 3 x 1 minuts skylning i sterilt vand. Herefter tørrer frøene minimum 2 timer i sterilbænk før bejdsning med antagonisten. Konidiesuspensioner til bejdsning fremstilles som beskrevet afsnit 2.1. TiI alle forsøg anvendes et sphagnum/klid præparat lagret 20 uger ved 4°C i koncentrationen 1 x 10⁸ og 1 x 10⁹ sporer/ml.

Patogenet

Isolatet HB2 af P. ultimum, der opbevares ved 4°C på inficerede græsblade, anvendes til fremstilling af oospore inokulum. Oosporerne produceres på sphagnum som beskrevet af Green (1996). Koncentra-tionen af oosporer pr. g tørret inokulum bestemmes ved lysmikroskopi i tællekammer.

Opsætning af bioassay

Plastpotter 5 x 5 cm med underskåle tilsættes 100 ml vermiculit (grad II), vandes med 50 ml næringsopløsning (Hornum, 5ml/l), hvorefter der såes 12 frø per potte. Frøene dækkes med 30 ml vermiculit hvori, der om- hyggeligt er iblandet oosporeinokulum svarende til 15000 oosporer/potte. I usmittede kontrolbehandlinger udelades tilsætning af oosporer. Potterne eftervandes med 20 ml næringsopløsning. De tilsåede potter placeres på bakker i plastposer monteret med trådnetstativer for at opretholde en høj luftfugtighed. Dyrkningen sker i klimakammer ved 15°C, 12 timers lys. Hver behandling består af 6 gentagelser, der randomiseres i to blokke med 3 gentagelser per blok (bakker).

Opgørelse

Fremspiring bestemmes som antal planter, der har gennembrudt vækst-mediets overflade. Sygdomsindekset bedømmes på rødder og kimstængel af vaskede planter efter følgende skala: 0=helt rask plante, 1=brunlig plet på rødder eller kimstængel, 2=brunfarvning af rødder eller brun ringdannelse på kimstænglen, 3=planten væltet eller død. Endvidere tildeles uspirede frø sygdomsgraden 3. Det gennemsnitlige indeks per potte og behandling beregnes.

7.2 Resultater for Pythium ultimum

Der er udført kontrollerede forsøg i klimakammer for at belyse om bejdsning med G. roseum har bekæmpelseseffekt overfor jordbårent oospore inokulum af P. ultimum.

Bejdsning har i forsøg med højt sygdomsniveau reduceret Pythium angrebet signifikant (Tabel 7.1 og 7.2). Endvidere medfører bejdsning en plantefremspiring, der er ca. dobbelt så høj som i sygdomskontrollen. Ved det meget lave Pythium sygdomsniveau (Tabel 7.3), er der desuden en klar tendens til at bejdsning har reduceret sygdomsangrebet.

Tabel 7.1. Biologisk bekæmpelse P. ultimum ved bejdsning af sukkerroefrø med lagrede konidier af G. roseum.

7.1. Biological control of P. ultimum by coating seeds of sugar beet with stored conidia of G. roseum.

1) Der er sået 12 frø per potte.
2) SI- værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 7.2. Biologisk bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning af sukkerroefrø med lagrede konidier af G. roseum.

7.2. Biological control of Pythium ultimum by coating seeds of sugar beet with stored conidia of Gliocladium roseum.

1) Der er sået 12 frø per potte.
2) SI- værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 7.3. Biologisk bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning af sukkerroefrø med lagrede konidier af G. roseum.

7.3. Biological control of P. ultimum by coating seeds of sugar beet with stored conidia of G. roseum.

1) Der er sået 12 frø per potte.
2) SI- værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

7.3 Diskussion

Klimakammerforsøgene har vist, at bejdsning af roefrø med G. roseum (IK726) reducerer angrebet af P. ultimum forårsaget af jordbårent inokulum af patogenet. Som det fremgår af Tabel 7.2, hvor alle planter i Pythium kontrollen er døde, er bekæmpelse er også mulig, selvom angrebet er meget voldsomt. Tilsvarende undersøgelser udført af Hansen (1997) bekræfter, at frøbejdsning med IK726 kan bekæmpe P. ultimum i sukkerroe ved højt sygdomstryk.

Megen forskning omkring biologisk bejdsning af frø har været rettet mod beskyttelse af frø- og kimplanter mod jordbårne plantesygdomme herunder også rodbrand forårsaget af P. ultimum. I mange tilfælde har isolater, der har vist sig effektive under laboratoriebetingelser været ineffektive under naturlige forhold. Det skyldes formodentlig blandt andet, at P. ultimum kan spire og inficere udsåede frø i løbet af 4-24 timer (se introduktionen i kapitel 4). Da patogenet spirer hurtigere end de fleste svampeantagonister stiller bekæmpelse af rodbrand ved bejdsning store krav til formuleringen af antagonisten. I den forbindelse kan fyldstoffer og klæbemidler spille en vigtig rolle. Harman & Taylor (1988) viste, at ved formulering af T. harzianum med fyldstoffet agrolic (pH 4.1) kunne bekæmpelsen af P. ultimum forøges signifikant ved sammenligning med formulering med et mere basiske fyldstof (pH=6.5). Det skyldes formodentlig, at det sure miljø der lokalt skabes i spermosfæren fremmer væksten af antagonisten mere end det fremmer væksten af patogenet. Miljøet for antagonisten kan også optimeres ved at skabe en fysisk barrierer mellem antagonist og patogen. Med film-coatings teknik kan frø tilføres et tyndt ubrudt lag (<0.1 mm) bestående af antagonist, fyldstof og klæbemiddel. Taylor et al. (1991) viste, at den fysiske barriere, skabt ved en sådan coatning, giver antagonisten mulighed for at udnytte exudater fra frøet i de primære spiringsstadier før patogenet, og dermed får antagonisten en konkurrencemæssig fordel til at etablere sig på frøet. Samtidig forlænger den fysiske barriere Pythiums infektion af frøet med 5-6 timer (Taylor et al., 1991). En gennemgang af litteraturen viser desuden, at den bedste bekæmpelse af Pythium generelt er opnået ved bejdsning med rhizosphere kompetente antagonistiske isolater (se afsnit 10.3). IK726 har i de udførteforsøg reduceret sygdomsniveauet af Pythium rodbrand selvom konidier er tilført frøene i en simpel vandig suspension. Det skyldes formodentlig at IK726 spirer relativt hurtigt (se afs. 4) og at IK726 ifølge foreløbige undersøgelser udviser en god rodkoloniseringsevne, i hvertfald på kornplanter (se kapitel 10). Det er dog muligt at bejdsningmetode og formulering skal optimeres for at opnå effektiv bekæmpelse under markforhold.

IK726 i markforsøg

IK726's potentiale med henblik på kommerciel biologisk bejdsning af sukkerroefrø undersøges i øjeblikket af frøfirmaet Danisco Seed. Antagonisten tilføres frøene ved hjælp af en specialudviklet film-coatnings teknik, som firmaet generelt anvender til frøbejdsning. Herved undersøges det, om IK726 umiddelbart kan indpasses i den eksisterende frøbejdsningsteknik. Dernæst udsåes bejdsede frø i markforsøg for at undersøge antagonistens effekt under naturlige forhold overfor jordbårne patogener som Pythium, Rhizoctonia, Aphanomyces, Fusarium etc. (resultater foreligger endnu ikke).