Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø

8 Undersøgelser af Gliocladium roseum formuleret og lagret på frø: shelf-life og bekæmpelse i bioassay

8 Undersøgelse af Gliocladium roseum formuleret og lagret på frø: shelf-life og bekæmpelse i bioassay
8.1 Materialer og metoder
8.2 Resultater
8.3 Diskussion og konklusion

En kommercialisering af biologisk frøbejdsning vil være et mere realistisk alternativ til de kemiske midler, såfremt frø bejdset med G. roseum kan lagres i flere måneder. I den forbindelse må det overvejes hvilket temperaturområde, der er realistisk for lagring af biologisk bejdsede frø af en specik planteart. Cliquet & Scheffer (1996) har vist at overlevelsen af Trichoderma harzianum sporer på radisefrø påført ved film-coating, er stærkt afhængig af såvel temperatur som svampeisolat. For de to bedste isolater, observerede de en reduktion i overlevelsen på en faktor 10 efter 3 måneders lagring ved 15°C og et tilsvarende fald i overlevelsen efter 5 måneders lagring ved 4°C (Cliquet & Scheffer, 1996).

Overlevelsen på frø evalueres som oftest ved in vitro tests, hvor sporer vaskes af frøene og pladespredes på agar. Herudfra kan antallet af spiredygtige sporer pr. frø estimeres. Ud over at den aktive ingrediens i et biologisk præparat (som oftest sporer) skal kunne overleve i en spiredygtig form, er det naturligvis også vigtigt at undersøge, om de overlevende sporer har bevaret deres evne til at bekæmpe patogener. Det er en test, der som minimum må fortages i plantebioassay (jfr. introduktionen i kapitel 5).

Formål

Formålet med nærværende forsøg er at undersøge, hvordan lagring af bygfrø bejdsede med G. roseum (IK726) konidier influerer på antagonistens overlevelse og biologisk bekæmpelsesaktivitet. Herunder (1) effekter af lagertid og lagertemperatur, (2) effekt af anvendt formuleringsmetode, og (3) bekæmpelseseffektivitet overfor udsædsbårent inokulum af Fusarium culmorum og Biplaris sorokiniana.

8.1 Materialer og metoder

Undersøgelserne af overlevelse og bekæmpelseseffekt efter lagring af bejdsede frø er udført som parallelforsøg. Overfladesteriliserede frø, bejdset med de forskellige behandlinger, er anvendt til in vitro bestemmelse af overlevende antal cfu pr. frø ved afvaskning og pladespredning på PDA. Frø af sorten "Alis Abed" naturligt inficeret med B. sorokiniana, eller frø af "Alis Abed" smittet med F. culmorum er bejdset med tilsvarende behandlinger til bedømmelse af bekæmpelses-effektivitet i plantebioassay. Metoder til bejdsning og bestemmelse af cfu/frø samt metoder til opsætning og bedømmelse af bioassay er beskrevet i detaljer i afsnit 5.1 (bedømmelse af B. sorokiniana er beskrevet i afsnit 6.1). Der blev anvendt overflade-steriliserede frø af "Etna Abed" til B. sorokiniana parallelforsøgene og frø af "Alis Abed" til F. culmorum til parallelforsøget.

Klæbemidler

Effekten af klæbemidler på overlevelsen af IK726 blev undersøgt ved enkeltvis tilsætning af midlerne til bejdsesuspensionerne; Pelgel og carboxymethylcellulose (CMC) ( 2%, w/v) samt Teprosyn og Sepiret (10%, w/v). Klæbemidlerne er nærmere specificeret i afsnit 5.1.

Optimeret formulering

I afsnit 8.2 beskrives resultater vedrørende overlevelse og bekæmpelses-effekt for bejdsning med optimerede formuleringer af IK726. Metoderne er ikke yderligere beskrevet i rapporten, men blot angivet som optimeret formulering Type B og Type D. Det skyldes, at forhold vedrørende nyhedsværdi og patentering endnu ikke er afklaret, hvorfor forhold, der med stor sandsynlighed er patenterbare, beskyttes.

8.2 Resultater

Resultater vist i figur 8.1-8.2 samt i tabel 8.1 omhandler udelukkende standardformuleringer af G. roseum (IK726). I figur 8.3- 8.4 samt i figur 8.5-8.6 indgår der derimod optimerede formuleringstyper, henholdsvis Type D og Type B.

Klæbemidler

I figur 8.1 og 8.2 ses overlevelseskurver for IK726 applikeret til overfladesteriliserede bygfrø, der er lagret ved henholdsvis ved 4°C og ved 20°C. Frøene er bejdset med vandig suspension af konidier eller med konidiesuspensioner tilsat et af klæbemidlerne Sepiret, CMC, Teprosyn eller Pelgel. Som det fremgår af figur 8.1 og 8.2 reduceres konidiernes overlevelse på bejdsede frø med en faktor 5-10 i løbet af de 24 timer, hvor de bejdsede frø tørres tilbage inden de lægges til lagring. Reduceret overlevelse som følge af nedtørring sker desuden uafhængigt af om konidierne er applikeret med klæbemiddel eller med vand. Ved lagring af bejdsede frø ved 4°C er der for alle behandlinger et lineært fald i overlevelsen set over en 52 ugers lagerperiode (Figur 8.1). Overlevelse ved formulering med Pelgel reduceres kun med faktor 10 over de 52 uger mod en reduktion med en faktor 1000 for Teprosyn, mens overlevelsen for konidier applikeret uden klæbemiddel reduceres med en faktor 100 i løbet af 52 uger (Figur 8.1).

I figur 8.2 er overlevelsen af IK726 vist for bejdsede frø lagret ved 20°C. Antagonisten overlever kun få uger ved denne temperatur og allerede efter 3 uger er der generelt mindre end 100 cfu pr. frø. Applikation af IK726 i kombination med klæbemidler har ingen positiv effekt på overlevelsen ved 20°C.

 (3 Kb)

 (3 Kb)

For at undersøge bekæmpelseseffekten overfor F. culmorum efter lagring af bejdsede frø, blev F. culmorum smittede frø bejdset med IK726 konidier med og uden Pelgel og lagret ved 4°C. Til hvert testtidspunkt (0, 4, 7 g 14 uger) blev F. culmorum smittede frø desuden bejdset med friskhøstede konidier af IK726, som en yderligere kontrol af, om lagring af bejdsede frø resulterer i tab af bekæmpelsesaktivitet. Som det fremgår af tabel 8.2 har bekæmpelseseffektiviteten af konidier lagret på frø ved 4°C været stabil i op til 14 uger og lige så effektiv som bejdsning med friske konidier. Desuden har tilsætning af Pelgel ved bejdsningen ikke influeret på bekæmpelseseffekten i bioassay.

Tabel 8.2. Bekæmpelse af frøbårent inokulum af F. culmorum ved bejdsning med konidier af G. roseum (G.r.) efter lagring af bejdsede frø i 0, 4, 7 og 14 uger ved 4°C.

Table 8.2. Biological control of seedborne inoculum of F. culmorum after coating seeds of barley with conidia of G. roseum (G.r.) after storage of coated seeds for 0, 4, 7 and 14 weeks at 4°C.

1) Indenfor kolonner er SI-værdier efterfulgt af forskellige bogstaver signifikant i følge Duncan's multiple range test.

Produktionsmetode

I figur 8.3 og 8.4 ses resultater fra forsøg med IK726 bejdsede og lagrede frø, der er udført med henblik på at undersøge produktionsmetodens indflydelse på IK726´s overlevelse (Figur 8.3) og bekæmpelseaktivitet overfor B. sorokiniana (Figur 8.4). IK726 er opformeret ved henholdsvis flydende og fast fermentering i kombination med optimeret formulering Type D. Bejdsede frø er lagret ved 4° og 20°C. For bejdsede frø lagret ved 4°C er overlevelsen stabil i ca. ½ år uanset produktions-metode (Figur 8.3). Derimod viser lagring af bejdsede frø ved 20°C, at konidier fra fast fermentering overlever bedre end konidier fra flydende fermentering, idet overlevelsen kun reduceres med en faktor 10 efter 12 uger lagring, mens overlevelsen af konidier fra flydende fermentering er reduceret med en faktor 10 allerede efter 6 ugers lagring ved 20°C. Desuden er alle konidier fra flydende fermentering døde efter 14 ugers lagring, mens der stadig efter 20 ugers lagring er et lavt niveau af levedygtige fast fermenterede konidier på frøene (Fig.8.3).

Frø naturligt inficeret med B. sorokiniana blev som ovenfor bejdset med konidier af IK726 fra fast og flydende fermentering og lagret ved 4°C og 20°C. I Figur 8.4 ses kurver for bekæmpelseseffektivitet som funktion af lagertid for de fire behandlinger. Generelt har kurverne for bekæmpelse samme forløb som de tilsvarende kurveforløb for overlevelse (Figur 8.3). Bekæmpelseseffektiviteten efter lagring ved 4°C har stabilt ligget på 80-90% efter 32 ugers lagring, uanset om der er bejdset med konidier fra fast eller flydende fermentering (Figur 8.4). For lagring ved 20°C er bekæmpelsen for fast fermenterede konidier opretholdt på ca. 80% i 8 uger for derefter at falde lineært til ca. 40% efter ca. 20 uger lagring. For konidier fra flydende fermentering reduceres bekæmpelseseffekten derimod til ca. 40% i løbet af 10 ugers lagring (Figur 8.4).

 (3 Kb)

 (4 Kb)

Produktionstid og optimeret formulering

I figur 8.5 ses resultater for overlevelsen ved 20°C af G. roseum (IK726)

konidier på overfladesteriliserede bygfrø. Effekten af to produktionstider (12 og 20 døgn) i kombination med enten standardformulering eller optimeret formulering (Type B) er undersøgt. Med optimeret formulering (type B) er overlevelsen uændret efter 10 ugers lagring, hvorefter der sker en reduktion med ca. en faktor 10 efter ialt 25 ugers lagring. Optimeret formulering har således medvirket til en stabilisering af overlevelsen af IK726 på frø lagret ved 20°C, idet overlevelsen ved ikke optimeret formulering kun er stabil i 4 uger for derefter at falde lineært til 0 (ingen overlevende konidier) efter 25 ugers lagring. Det ses endvidere, at effekten af optimeret formulering er uafhængig af konidiernes produktionstid (Fig. 8.5).

 (4 Kb)

I figur 8.6 ses kurver for den procentvise bekæmpelse (i forhold til sygdomskontrollen) af udsædsbårent inokulum af Bipolaris sorokiniana over en periode på 34 uger, hvor bejdsede frø har været lagret ved 20°C. Der er som ovenfor bejdset med konidier af IK726 opformeret ved fast fermentering i henholdsvis 12 og 20 døgn og formuleret med eller uden optimeret formulering (type B) Kurveforløbene for bekæmpelseseffekten af de fire behandlinger svarer generelt til kurverne for overlevelse vist i figur 8.5. Ved optimeret formulering (type B) har bekæmpelseseffekten været >80% i op til 30 uger. Uden optimering har bekæmpelsen været >80% i op til 15 uger for konidier med en produktionstid på 20 døgn og på et lidt lavere niveau (>70%) i samme periode for konidier med en produktionstid på 12 døgn. Herefter reduceres bekæmpelseeffektiviteten markant til mindre end 50% bekæmpelse af Bipolaris sorokiniana.

 (5 Kb)

8.3 Diskussion og konklusion

I denne del af projektet er effekten af produktionsmetoder og formulering ved bejdsning af frø med G. roseum (IK726) undersøgt med henblik på at teste, dels konidiernes overlevelse på frø, og dels deres bekæmpelses-effektivitet overfor sygdomme fremkaldt af udsædbårent inokulum af B. sorokiniana og F. culmorum. Bejdsede frø er lagret i op til 52 uger.

Lagring ved 4°C

For lagring af coatede frø ved 4°C er overlevelsen af IK726 i nogen grad afhængig af formuleringen. For frø bejdset med standardformulering ± klæbemiddel er overlevelsesevnen ved 4°C stabil i 3 til 4 måneder, herefter reduceres cfu/frø lineært (Figur 8.1). Bekæmpelseseffekten målt i F. culmorum bioassay har været stabil i en lignende periode (14 ugers lagring ved 4°C) og ligeså effektiv som bekæmpelse opnået ved bejdsning med frisk høstede konidier af IK726 (Tabel 8.2). En yderligere stabilisering af IK726´s overlevelse på frø ved 4°C er opnået ved anvendelse af optimeret formulering (Type D), idet overlevelsen har været stabil i ca ½ år for denne formuleringstype (fig. 8.3). Den biologiske bekæmpelsesaktivitet af de på frø lagrede konidier er desuden opretholdt i ca. 8 måneder, idet der kontinuert i denne perioder har været mere end 80% bekæmpelse af Bipolaris fodsyge fremkaldt af udsæds-bårent inokulum af B. sorokiniana.

Lagring ved 20°C

Overlevelsen af IK726 konidier på bygfrø er meget følsom overfor en stigning i lagertemperatur fra 4°C til 20°C. Når frø bejdses med standardformuleringer af IK726 falder overlevelsen til nul i løbet af 7-8 uger og tilsætning af klæbemidler synes ikke at influere positivt på overlevelsen ved 20°C (Fig. 8.2). Optimeret formulering Type D eller Type B har en stærkt stabiliserende effekt på konidiernes overlevelses-evne og bekæmpelseseffektivitet. Ved optimeret formulering Type D ses en meget svagere reduktion i overlevelsen over tid, og selv efter 15 ugers lagring ved 20°C er der stadig en del levende konidier på de frø, der er bejdset med konidier fra fast fermenting (Fig. 8.3). Tendensen til at konidier fra fast fermentering er mere robuste og tåler lagring ved 20°C bedre end eksempelvis konidier fra flydende fermenteret underbygges også af resultaterne fra bekæmpelsesassays (Fig. 8.4), hvor den højeste og mest stabile bekæmpelse forekommer efter bejdsning med konidier fra fast fermentering. En yderligere bekræftelse på, at fast fermenterede konidier af IK726 er mest robuste understreges af, at de også overlever bedst i molersformuleringer lagret ved 20°C (se Figur 3.10). En lignende sammenhæng er også fundet for andre svampeantagonister. Cliquet & Scheffer (1997) har eksempelvis vist, at konidier af Trichoderma harzianum produceret ved fast fermentering overlever bedre på frø af radise end konidier fra flydende fermentering.

Optimeret formulering

Med optimeret formulering Type B er der opnået en yderligere forbedring af overlevelsen ved 20°C sammenlignet med Type D formuleringen. Konidiernes levedygtighed er stabiliseret i op til 10 uger og set over 25 ugers lagring falder overlevelsen kun med en faktor 10 (Fig 8.3). Lige så positivt er det, at bekæmpelsesprocenten bedømt i B. sorokiniana bioassay har været stabilt >80% i op til 30 uger (7½ måned) for Type B formuleringen.

Generelt ses en meget nær sammenhæng mellem konidiernes overlevelseevne og deres bekæmpelseseffektivitet. Det indikerer, at såfremt konidierne er levedygtige på frøet, så har de også bevaret et højt niveau af potentiel biologiske bekæmpelsesaktivitet. Det er dog klart at frøpartier lagret under disse forhold også må evalueres under markforhold, på trods af, at der er fundet en overordentlig god korrelation mellem resultater opnået i bioassay og resultater opnået under markforhold (se afsnit 9.2, fig 9.1).

Vitalitet af konidier lagret på frø

Kurveforløbet for den procentvise bekæmpelse af B. sorokiniana er i store træk identisk med kurveforløbet for overlevelsen af IK726 på frø (cfu/frø) når de to kurver sammenlignes for specifikke bejdsebehandlin-ger. Generelt har bekæmpelsen været >80%, når det samtidig er estimeret, at der er >2-5 x 10³ cfu per frø. Når overlevelsen falder under 10³ cfu/frø, indtræffer der nogenlunde samtidigt et markant fald i bekæmpelses-aktiviteten. Dette er i overensstemmelse med resultater fra en række bioassay med B. sorokiniana (Kapitel 6), hvor frøene er bejdset umiddelbart før udsåning. For konidier, der således ikke er lagret på frø er det estimeret at >80 bekæmpelse i langt de fleste tilfælde opnåes, når der er mere end 1 x 10³ cfu/frø, samt at bekæmpelsen tilsvarende falder lineært, når dosis gradvist reduceres. Der er således ikke noget der tyder på, at konidier der er levedygtige efter flere måneders lagring på frø har mistet vitalitet af signifikant betydning for deres bekæmpelsesaktivitet.

Kommercielle krav

Ved en specifik anvendelse af IK726 til bejdsning af korn, vil en realistisk lagertemperatur for udsæd af kornarterne under nordiske forhold typisk være på 15°C. For vårbyg er det desuden realistisk at påregne, at de bejdsede frø skal kunne lagres i op til 8 måneder, hvilket svarer til den tidsperiode, der maksimalt går fra høst af sædekorn og til såning i marken. Vinterhvede udsåes derimod kort efter høst (september-oktober), hvorfor kravet til lagring af bejdsede frø af hvede realistisk set kan sættes til maksimalt 3 måneder. Under de givne forudsætninger bør biologisk bejdset udsæd af korn således kunne lagres i op til 8 måneder ved 15-20°C for at kunne fremstå som et realistisk alternativ til eksempelvis kemisk bejdsning. Opbevaring af frø ved 4°C kan dog være praktisk mulig for frø af højværdi afgrøder med lav frøvægt som eksempelvis visse grøntsager.

Konklusion

På baggrund af de formodede realistiske krav til opbevaring af biologisk bejdset korn, nemlig 8 måneder for byg og 3 måneder for hvede ved højst 20°C, synes mulighederne for praktisk anvendelse af G. roseum (IK726) at være gode. IK726 kan overleve stabilt på bejdsede frø i mindst et halvt år ved 20°C og har over en 7½ måneds lagerperiode ved 20°C udvist en stabil bekæmpelse af udsædsbårent inokulum af B. sorokiniana. Der synes derfor at være meget gode muligheder for at anvende IK726 til biologisk bejdsning af korn i praksis, specielt når det gælder hvede, der ofte kun lagres få uger efter at bejdsningen er udført.