| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Vurdering af muligheder og begrænsninger for recirkulering af næringsstoffer fra by til land

3. Materialer og metoder

Undersøgelsesperioder

De 4 projekter blev udvalgt som repræsentanter for forskellige teknologiske løsninger i forskellige bebyggelser med forskellige brugere.

Undersøgelserne omfattede prøver udtaget fra urinopsamlingstanke i de enkelte projekter. Prøverne blev udtaget månedligt med i alt 7 prøveindsamlinger fra Hyldespjældet (tank 2) og Møns Museumsgård i perioden november 1999 til maj 2000 og i 4 prøveindsamlinger fra Kolonihaveforbundet i perioden oktober 1999 til januar 2000. Urin fra beboere i Hjortshøj blev besluttet indsamlet efter projektets begyndelse for at få indsamlet flere resultater vedrørende forekomst og overlevelse af smitstoffer. Prøveudtagningen i Hjortshøj blev påbegyndt 3 måneder efter urintilførslen til tanken blev stoppet. I alt blev der udtaget 4 prøver fra Hjortshøj i perioden marts 2000 til juni 2000. I juli 2000 blev der udtaget yderligere prøver fra Hyldespjældets tank 3, 4 og 5. Ved tidspunktet for den første prøveudtagning (t0) var urintankene/beholderne blevet tillukket og yderligere urintilførsel standset. Eventuelle kim og smitstoffer i urinen vil således ved t0 have været eksponeret for urinmiljøet i varierende tidsperioder fra få uger til få måneder afhængig af blandt andet tidsrummet for fyldning af tanken.

Tabel 3.1
Oversigt over tidspunkter for prøveudtagning fra Tema 3 projekterne

Prøvetagning

Prøver af urin fra Møns Museumsgård, Hyldespjældet og Kolonihaveforbundet blev udtaget af laboratoriet ROVESTA Miljø I/S, Næstved. Prøverne blev udtaget fra tanke isat cirkulationspumper efter 10-20 minutters omrøring. Der blev udtaget 1 l urin i sterile vacuumflasker til henholdsvis bakterielle undersøgelser, parasitologiske undersøgelser samt kemiske undersøgelser. Prøverne fra Kolonihaveforbundet blev transporteret og opbevaret ved Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole (KVL) i 10 l plastdunke.

Prøver fra Hjortshøj blev udtaget af en beboer med erfaring i prøveindsamling. Prøverne blev taget fra tank 1, hvori der var monteret en cirkulationspumpe og efterfølgende sendt til analyselaboratorium.

De fysisk-kemiske parametre og de bakteriologiske undersøgelser blev foretaget af ROVESTA Miljø I/S; de parasitologiske undersøgelser af Statens Seruminstitut og Statens Veterinære Serumlaboratorium og de kemiske undersøgelser af firmaerne MILJØKEMI (næringsstoffer, tungmetaller og miljøfremmede stoffer), samt Medilab, København (paracetamol, acetylsalicylsyre og østrogenlignende stoffer). Prøverne blev transporteret til laboratorierne i isolerede plastbokse med kølelegeme, og de bakteriologiske undersøgelser blev påbegyndt samme dag.

3.2 Fysisk-kemiske parametre

Ved hver prøvetagning blev pH, temperatur og udseende bestemt umiddelbart efter prøveudtagning. Temperaturen ved opbevaring af prøverne fra Kolonihaveforbundet ved KVL var 18-20^oC. Fra marts 2000 blev der målt pH og temperatur på prøverne fra Møns Museumsgård og Hyldespjældet i laboratoriet efter transport og ikke som tidligere ved feltmåling i urintankene.

3.3 Indikatororganismer

Kimtal ved 37^oC

Kimtal ved 37^oC blev bestemt som tælling af synlige kolonier på Plate Count Agar efter inkubering ved 37^oC i 48 timer (DS 2254, 1983). Detektionsgrænsen for undersøgelsen var 100 bakterier pr. ml. Urinprøverne blev fortyndet ved 10-folds fortyndinger med 0,01 ml som det største undersøgte volumen.

E. coli

Antal E. coli blev bestemt efter membranfiltrering af 10 x 10 ml urin (ialt 100 ml) gennem 0,45 m m filtre, som efterfølgende blev inkuberet på Membran Lauryl Sulfat Agar ved 44^oC i 1 døgn. De typiske gule kolonier blev talt og verficeret i Lauryl Sulfat Laktose Tryptophan Bouillon ved positiv indol reaktion og luftdannelse (ISO/DIS 9308-1, 1997). Detektionsgrænsen var 10 bakterier pr. 100 ml.

Enterokokker

Antal enterokokker blev bestemt ved membranfiltreringer (0,45 m m) af op til 100 ml urin. Filtrene blev inkuberet på Slanetz & Bartley Agar ved 37^oC i 2 døgn, hvorefter de fremkomne positive kolonier blev verficeret på Galde Æskulin Agar (ISO/DIS 7899/2, 1997). Detektionsgrænsen var 10 bakterier pr. 100 ml.

3.4 Smitstoffer

Campylobacter jejuni/coli

En prøvemængde på 10 ml urin blev overført til lukkede flasker med 100 ml Preston Bouillon tilsat vækstfremmer (blod) og væksthæmmer (antibiotika). Prøven blev inkuberet ved 42^oC i 1-2 døgn. Efterfølgende blev en del af prøven udsået på CCDA (blodfrit selektivt Campylobacter medium), som blev inkuberet i mikroaerofil atmosfære ved 42^oC i 3-5 døgn inden aflæsning for vækst. Der blev udført parallelle analyser med C. jejuni og C. coli til kontrol af metoden (NMKL 119/2, 1990).

Salmonella

En prøvemængde på 10 ml urin blev membranfiltreret (0,45 m m filter) med efterfølgende opformering af filteret i 100 ml Bufferet Pepton-vand ved 37^oC i 1 døgn. Herfra blev 0,1 ml overført til Rappaport-Vassiliadis (RV) Bouillon med efterfølgende opformering ved 41,5^oC i 1 døgn. Fra RV- bouillonen blev 10 m l udstrøget på Brilliantgrøn Laktose Sakkarose Fenolrød (BLSF) agar , der blev inkuberet ved 37^oC i 1 døgn og aflæst for typiske, rødlige kolonier. Der blev udført parallelle analyser med Salmonella typhimurium og Salmonella enteritidis til kontrol af metoden (DS266/1, 1999).

Cryptosporidium parvum

Påvisning af Cryptosporidium parvum blev foretaget af Statens Seruminstitut (SSI) og Statens Veterinære Serumlaboratorium (SVS).

Ifølge måleprogrammet skulle SSI varetage alle parasitundersøgelser af urinen fra samletankene. Da der imidlertid i nogle af urintankene blev fundet cryptosporidier, blev yderligere cryptosporidieundersøgelser igangsat. Urinprøver med positive fund af cryptosporidier blev sendt til SVS, der udfører identifikation af protozoerne Cryptosporidium og Giardia med mere specifikke diagnostiske teknikker end SSI. SVS foretog således kvalitative og kvantitative bestemmelser af Cryptosporidium og Giardia i urin, viabilitetsbestemmelser, samt infektionsforsøg i mus.

Påvisningsmetoder

SSI foretog den indledende diagnostik v.h.a. en syre-fast (modificeret Ziehl-Nielsen) farvning på urinkoncentrat af 1000 ml urin. Ved positive fund af Cryptosporidium parvum blev et urinkoncentrat videresendt til SVS, som foretog kvalitative og kvantitative bestemmelser ved en specifik immunoflourescens-baseret metode (MERIFLOUR Cryptosporidium/ Giardia kit, Meridian Diagnostics, INC.), samt modificeret Ziehl-Nielsen farvning. Detektionen af Cryptosporidium og Giardia blev foretaget ved anvendelse af det flourescens-mærkede monoklonale antistof rettet mod antigener i parasitæggene. Æggene fra Cryptosporidium parvum benævnes oocyster, mens æggene fra Giardia benævnes cyster.

Bestemmelse af viabilitet

Viabilitetsbestemmelserne blev lavet med en DAPI/PI (4’,6-diamidino –2-phenylindole/propidium iodide) farvemetode, som er baseret på inklusion eller eksklusion af flourescerende vital farver i parasitæggene. Ved mikroskopi skelnes mellem følgende: tomme oocyster (DAPI/PI -/-), som ikke optager nogen farvestoffer; inklusion af begge farvestoffer (DAPI/PI +/+), som indikerer letal beskadigelse af celle væggen; inklusion af DAPI (DAPI/PI +/) som indikerer en metabolisk aktiv celle væg; samt synlig infrastruktur uden optagelse af farvestof (DAPI/PI -/-), der indikerer muligt levende oocyster (Jenkins et al., 1997).

Tabel 3.2
Korrelation mellem Cryptosporidium parvum oocysters viabilitet og evne til at optage flourescerende vital farver.

* DAPI-/PI- oocyster kan konverteres til DAPI+/PI- og vice versa.

Museinfektionsforsøg

Ved en infektion med C. parvum vil der ske en opformering af oocyster i musens tarmceller. Oocyster der ikke forårsager en infektion vil derimod blive udskilt med fæces, og ikke kunne påvises i musens tarmkanal 7 dage efter tilførsel af oocyster.

Til museinfektionsforsøg blev der anvendt udavlede, neonatale mus, 1-4 døgn gamle. Musene blev tilført 100 m l suspension indeholdende ca. 50 C. parvum oocyster. Oocysterne blev opkoncentreret fra urin ved centrifugering (prøven fra Møns Museumsgård) eller immunomagnetisk separation ved hjælp af Dynabeads GC-Combo test kit (Dynal A/S, Norge) (prøven fra Hyldespjældet). Musene blev aflivet 7 dage efter tilførsel af oocyster, hvorefter en del af tarmkanalen blev findelt og opkoncentreret. Indholdet af musenes tarmkanal blev undersøgt ved det specifikke immunoflourescens kit for forekomst af C. parvum oocyster.

Giardia

Foruden undersøgelser for Cryptosporidium er der også undersøgt for protozoen Giardia ved SSI, samt ved SVS. Ved SVS anvendtes det specifikke immunoflourescens kit (MERIFLOUR Cryptosporidium/ Giardia kit, Meridian Diagnostics, INC.).

Andre tarmpatogene parasitter

SSI udførte analyser for rundorme og bændelorme æg ved standardmetode med opkoncentrering og identifikation i mikroskop.

Antal analyser ved negative fund

Principielt blev der for alle mikrobiologiske parametre ved negative fund, eksempelvis bakterielle smitstoffer eller antal bakterier under detektionsgrænsen, udført en efterfølgende analyse. Efter 2 på hinanden følgende analyser som gav et negativt resultat, ikke påvist eller under detektionsgrænsen, blev der ikke yderligere analyseret for den pågældende parameter.

3.5 Eksperimentelle undersøgelser

Urinprøver og måling af pH

Overlevelsesforsøg med bakterielle smitstoffer blev udført i urin indsamlet i Hyldespjældet fra opsamlingstankene 4 og 5. Urinen blev opsamlet i sterile 1 l infusionsflasker, der blev opbevaret i optil 4 dage inden forsøgene blev påbegyndt. Flaskerne blev opbevaret ved henholdsvis 7 og 20^oC. Inden påbegyndt forsøg blev pH målt dagligt i en uge.

Bakterielle smitstoffer

Bakterielle smitstoffer var referencestammer fra internationale stammekollektioner eller velkarakteriserede stammer fra kollektioner ved KVL. Bakteriestammerne repræsenterer de vigtigste årsager til bakterielt betingede tarminfektioner i ind- og udland.

De anvendte testbakterier var følgende:

1. Vibrio cholerae O1
2. Vibrio parahæmolyticus
3. Salmonella typhimurium
4. Salmonella enteritidis
5. Shigella dysenteriae
6. Shigella flexneri
7. E. coli 0157:H7
8. Campylobacter jejuni

Testbakterierne blev opformeret Brain Heart Infusion (BHI) bouillon i 16 -18 timer ved 37^oC. Dog blev Campylobacter jejuni opformeret i BHI bouillon i 44-48 timer ved 42^oC i mikroaerofil atmosfære. Efter fastlæggelse af standardvækstkurver for de enkelte bakterier blev koncentrationen bestemt til 10⁹-10¹¹ bakterier pr. ml efter opformering i BHI-bouillon.

Bakterieceller til overlevelsesforsøg i urin blev opkoncentreret ved centrifugering af 1 ml overnatskultur ved 4200 rpm i 20 min. Bakteriecellerne blev derefter opslemmet i fysiologisk saltvand inden overførsel til 1000 ml urin. Startkoncentration af bakterier blev fastlagt til 10⁶ – 10⁸ pr. ml urin. Efterfølgende blev antallet af bakterier i urinen bestemt ved forskellige tidsintervaller efter overførsel af bakterieceller. Antallet af bakterier blev bestemt efter 10-folds fortyndinger ved direkte punkt inokulation af 10 m l på relevante, selektiv agarmedier. Den største undersøgte volumen var 100 m l, med en detektionsgrænse på 10 bakterier pr. ml.

Til dyrkning af Vibrio arter anvendtes Thiosulfat-Citrat-Galde-Sakkarose (TCBS) agar; SSI-agar blev anvendt til påvisning af til Salmonella og Shigella (Blom et al., 1999); blodfrit selektivt Campylobacter-medium (CCDA) til påvisning af Campylobacter; og MacConkey agar til dyrkning af E. coli. Alle agarmedier blev inkuberet ved 37^o i 18-24 timer. CCDA agar blev dog inkuberet mikroaerofilt ved 42^oC i 44-48 timer. De anvendte medier anvendes rutinemæssigt til påvisning af smitstofferne og bygger alle på et selektivt og indikativt princip.

Overlevelsesforsøg blev lavet som dobbeltforsøg.