| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Forekomst af Legionella i varmvandssystem

2. Metoder

2.1 Udvælgelse af ejendomme

Udvælgelsen af ejendomme, herunder anvendelseskategori og type af varmtvandsanlæg, er primært sket ud fra følgende 3 kriterier: Beliggenhed i Hovedstadsregionen, hovedvægt på større beboelsesejendomme og et ønsket forhåndskendskab til ejendom og anlæg.

Med et forhåndskendskab har det været muligt at inddrage forskellige typer af varmtvandsanlæg i undersøgelsen. Dette omfatter anlæg med 1 varmtvandsbeholder (VVB), anlæg med flere varmtvandsbeholdere (2-3 VVB i serie, hvor kun den sidste før ledningssystemet opvarmer til den endelige temperatur), og anlæg med varmeveksler (VX) med eller uden supplerende varmtvandsbeholder.

Endelig er det forsøgt at fokusere på forskellige rørmaterialer i anlæggene, hvilket har været vanskeligt, da næsten alle har såkaldt galvaniserede stålrør (varmforzinkede). Der er dog to anlæg med kobberrør og et med rustfri stålrør. På enkelte anlæg må man regne med, at der på grund af ombygning kan forekomme korte afgreninger af plastrør (PEX) til tapsteder.

I de fleste tilfælde er udvælgelsen foregået på den måde, at en kreds af energikonsulenter er blevet spurgt om forslag til emner. Derefter er der taget kontakt til de anlægsansvarlige og truffet aftale om besøg og prøvetagning.

Under besøget blev anlægget gennemgået og alder på ejendom/anlæg, karakteristika om udformning, driftsforhold og forbrug blev noteret.

Der blev i alt udvalgt 22 ejendomme til undersøgelsen. Der er 10 ejendomme i Københavns og Frederiksberg kommuner (alle beboelse), 4 ejendomme i Københavns amt, 6 i Frederiksborg amt og endelig 2 i Roskilde amt. Geografisk omfatter området således hele Storkøbenhavn med opland ( 3 amter).

2.2 Prøvetagning

Prøvetagningen er foretaget i henhold til "Råd og anvisninger om Legionella", CAS Statens Serum Institut (29), der angiver en prøvetagningsinstruks A eller B. I begge tilfælde tappes 1 liter vand fra tapstedet i en steril prøveflaske indeholdende 85 mg kaliumthiosulfat. Efter instruks A tappes den første liter uden at vandet har løbet først. Efter instruks B fjernes først eventuelle slanger, spredere, filtre o.l. Hanen steriliseres ved flambering, hvorefter vandet skal løbe i en jævn stråle i mindst 5 minutter før flasken fyldes. Vandets temperatur efter prøvetagningen noteres.

I undersøgelsen er der i de fleste tilfælde benyttet instruks A. Efterfølgende har man ladet vandet løbe og målt og registreret temperaturen ved opnåelse af stabil temperatur - normalt efter 2 min.

Nitten ejendomme/anlæg blev besøgt i perioden oktober til december 1999, fra hvert anlæg blev der udtaget én vandprøve efter instruks A. I perioden ultimo februar til primo maj 2000 blev yderligere tre anlæg besøgt, og prøveudtagningen fra fem af de første anlæg blev gentaget for at sammenligne med de første prøver. På de otte anlæg i denne periode blev der hvert sted taget to vandprøver, henholdsvis efter instruks A og B. Det bemærkes, at i tilfælde af prøveudtagning efter instruks B har praksis været, at vandet løb kraftigt indtil en stabil temperatur var opnået typisk efter 3-5 min. I alt blev der således udtaget og analyseret 35 varmtvandsprøver.

Det er valgt at tage samtlige prøver fra tapsteder beliggende et stykke fra boilerrum, og altså ikke direkte fra VVB. Prøvetagningsstedet har i flere tilfælde været tilfældigt valgt, f.eks. en lejlighed hvortil man kunne få adgang (nogen hjemme), og i andre tilfælde bevidst et bruserum (ofte fra en taphane i bruserummet), eller et fjernt beliggende tapsted. I lejligheder har det været i badeværelse fra håndvask eller bruser eller fra køkkenhaner.

Når prøven er taget fra en bruser, er (hånd)bruserhovedet fjernet, og prøven er altid taget gennem bruserslangen, der normalt er af plast eller gummi.

Temperaturer i boilerrum (VVB, VX, ledninger) blev normalt registreret fra fastsiddende termometre eller ved visning på overvågningsudstyr, alternativt ved hjælp af håndbåret instrument.

2.3 Laboratoriemetoder

2.3.1 Påvisning af Legionella ved dyrkning

Vandprøverne blev leveret til Kontrollaboratoriet, CAS på Statens Serum Institut samme dag eller dagen efter prøvetagningen, og analysen blev påbegyndt inden for to døgn fra prøveudtagning.

Den anvendte analysemetode var en modifikation af ISO 11731(30). Denne modifikation danner grundlag for den kommende Danske Standard. Metoden bestod af direkte udsæd på selektiv agar, samt opkoncentrering (100 x ) ved membranfiltrering (0,2 m ) og yderligere opkoncentrering (10 x ) ved centrifugering 13.000 rpm i 10 minutter. For hvert trin udsås ved overfladeudsæd på selektiv agar. Der blev anvendt MWY-agar (Modificeret Wadowsky Yee Agar) (SSI Diagnostika) og GVPC (Glycin Vancomycin Polymyxin Cycloheximid Agar) (Oxoid GmbH). Pladerne blev inkuberet ved 36 °C og 42 °C og aflæst efter 3-5 dage og 7-8 dage.

Pladerne blev kontrolleret for vækst af andre bakterier eller svampe efter 1-3 dage. Ved generende vækst af disse udførtes syrebehandling (pH 2,2 i 5 min. ± 0,5 min. ved stuetemperatur) og varmebehandling (50 °C ± 2 °C i 30 min. ± 5 min.).

Ved aflæsningen undersøgtes kolonierne i stereomikroskop (10 x ) for karakteristisk udseende. Mulige legionellakolonier blev bekræftet ved sekundær udsæd på Blodagar 5 % (SSI Diagnostika) og selektiv agar (36 °C i 3 dage) eller med Legionella Latex Test Kit (Oxoid Ltd).

Den anvendte metode er kvalitetssikret bl.a. ved akkreditering og deltagelse i eksterne præstationsprøver, der har bekræftet tilfredsstillende kvantitativ påvisning af såvel Legionella pneumophila serogruppe 1 (diverse subtyper) og andre serogrupper, samt en række andre Legionella-arter.

2.3.2 Serogruppebestemmelse af Legionella isolater

Fra dyrkningspladerne fra hver vandprøve udvalgtes mindst fem kolonier, der omfattede alle tilstedeværende kolonityper, til bestemmelse af serogruppe. Subkulturer fra disse blev undersøgt ved hjælp af en latex agglutination test, Oxoid Legionella latex test (Oxoid Limited). Testen kan skelne mellem L. pneumophila serogruppe 1, L. pneumophila serogruppe 2 - 14 og Legionella species (non-L. pneumophila; seks forskellige arter). To til fem kolonier fra hver vandprøve blev videre undersøgt med paneler af monoklonale antistoffer (MAb) til serogruppe og subgruppe bestemmelse af L. pneumophila ved et enzym immuno assay (EIA) (31). Ved serogruppebestemmelse med disse MAb´s kan der skelnes mellem 15 serogrupper af L. pneumophila. Alle isolater, der blev bestemt til L. pneumophila serogruppe 1 med Oxoid latex testen, blev videre karakteriseret ved EIA med et panel af MAb´s, der (som minimum) skelner mellem to subgrupper af L. pneumophila serogruppe 1: MAb 3/1 reaktive isolater (Pontiac = virulente) og MAb 3/1 negative isolater (non-Pontiac = mindre virulente).

2.3.3 Påvisning af Legionella DNA i vandprøver ved PCR

2.3.3.1 Forbehandling af prøver

Fra alle vandprøver blev der efter opkoncentrering ved membran filtrering (100 x) fra dyrknings-proceduren sterilt udtaget 0,5 ml, 100 m l blev blandet i 300 m l af en 20 % w/v Chelex 100 resin (Bio-Rad). De resterende 400 m l blev centrifugeret 30.000 x g i 15 min., supernatanten blev kasseret, til bundfaldet blev der sat 300 m l Chelex 100 resin. Alle prøverne blev Vortex behandlet i 60 sek. og suspensionen blev inkuberet i en varmeblok ved 95° C i 10 min. Chelex resinen blev bundfældet ved centrifugering i 5 min. ved 20.000 x g. Der blev udtaget 10 og 5m l fra supernatanterne til PCR for påvisning af Legionella DNA. Fra en del vandprøver blev der også udtaget ca. 1 ml fra "råvandet" og 0,1 ml fra det 1000 x koncentrerede vand (membran filtrering og centrifugering). Disse prøver blev forbehandlet på samme måde som de 100 m l fra membran filtreringen.

2.3.3.2 PCR procedure

Til specifik opformering af Legionella DNA ved PCR blev der anvendt to sæt primere i hver reaktion (Multiplex PCR). Det ene sæt primere var rettet mod Legionella species 16S rRNA (rDNA) (31) og amplificerer et 430 basepar (bp) fragment af alle Legionella species 16S rDNA. Det andet primersæt var rettet mod en sekvenser af mip genet for L. pneumophila (mip primer sekvenser fra EnviroAmp Legionella kit; Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) og amplificerer et 168 bp fragment. Til hvert reaktionsrør var der tilsat en DNA amplifikationskontrol (et stykke g -DNA med endesekvenser så det amplificeres af primerne mod 16S rDNA), for at kunne identificere prøver, der er hæmmende for PCR reaktionen og derfor eventuelt falsk negative. Efter PCR blev amplifikatet analyseret ved gelelektroforese.

Legionella PCR er i denne udformning højst en semikvantitativ analyse, idet koncentrationen bedømmes ved en kombination af båndintensiteterne og ved hvilken fortynding, prøven er positiv hhv. negativ. Desuden analyseres på meget små prøvevolumia, der i kombination med at vand ofte indeholder komponenter som er mere eller mindre hæmmende for enzymreaktionen (polymerasen) giver en forholdsvis høj usikkerhed. Ved Legionella PCR påvises både døde og levende bakterier, alene af den grund er resultaterne ikke direkte sammenlignelige med dyrkning. Detektionsgrænsen for PCR er beregnet ud fra analysens evne til at påvise 1 – 10 genomkopier, og er ca. 10³ genomer (bakterier)/l med de anvendte opkoncentrerede vandprøver (1000 x) og den anvendte prøveforbehandling.