Økologisk byfornyelse og spildevandsrensning, 45 – Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

5 Diskussion

5.1 Projekt 1 Bakteriologi

NH₄ (ammonium) koncentrationen og pH er vigtige faktorer som påvirker mikroorganismers overlevelse i urin. Ammonium og andre kvælstofforbindelser virker giftig på mikroorganismer, som også påvirkes negativt af alkaliske pH forhold (pH i urin er typisk omkring 9). Undersøgelsens resultater viste en positiv korrelation mellem NH₄-indhold og pH med de højeste værdier målt i urin fortyndet med ingen eller begrænset mængder vand (Lokalitet 3 og 4; urin fra kolonihaver). Ved anvendelse af de relativt store 2-liters urinbeholdere til laboratorieforsøgene kunne der opretholdes et næsten konstant pH og NH₄ indhold i beholderne svarende til de forhold der findes i urinopsamlingstanke.

Startkoncentrationen af enterokokker i urin indsamlet fra åbne urinopsamlingstanke var højere (ca. 10³ - 10⁴ cfu/ml) sammenlignet med urin fra lukkede opsamlingstanke (ca. 10² cfu/ml). Dette skyldes, at åbne tanke blev tilført urin på prøveudtagningstidspunktet modsat de lukkede tanke som havde været lukket i et tidsrum forud for prøveudtagningstidspunktet. Urin fra åbne tanke var således tilført frisk (fækalt forurenet) urin. Forskellige startkoncentrationer af enterokokker medførte en tilsvarende variation i den hastighed hvormed antallet af enterokokker blev reduceret. Dette indikerer, at der i urin med høje enterokokkoncentrationer som følge af betydelig fækal forurening vil kunne påvises enteriokokker efter relativt længere lagringstid sammenlignet med urin med lave enterokokkoncentrationer.

Efter en reduktion af antal enterokokker til under detektionsgræsen på 1 cfu/ml blev der påvist en mindre stigning i antal enterokokker i urin fra Lokalitet 1 og især 2 efter 5-6 måneders opbevaring. Da enkelte andre bakterieslægter end enterokokker kan vokse på Slanetz & Bartley agarplader var det vigtigt at få fastlagt, at de fremvoksede bakteriekolonier virkelig var enterokokker. Det var endvidere også vigtig, at få bestemt enterokokarten da nogle arter kan forekomme naturligt i miljøet, eksempelvis i jord, mens andre næsten udelukkede forekommer i afføring fra mennesker og dyr. Slægt og art af udvalgte bakteriekolonier blev bestemt ved biokemisk karakterisering og PCR. Den videre karakterisering blev således udført for at kunne fastlægge om den registrede bakterielle vækst skyldes enterokokker tilført fra mennekser og ikke fra miljøet omkring urinopsamlingstanke.

Efter 4 måneders opbevaring af urin fra Lokalitet 1 blev 11/12 isolater identificeret som E. faecium, som alle havde en identisk DNA fingeraftrykstype (PFGE type A). E. faecium betragtes normalt som en strikt fækal enterokokart der overlever relativt dårligt udenfor mavetarmkanalen af dyr og mennesker. P.g.a. af den observerede stigning i enterokokantallet stammer disse identiske E. faecium isolater med stor sandsynlighed fra den samme bakteriecelle som følge af opformering i urinen. Det ser således ud til at en identisk E. faecium stamme udviste øget overlevelse og evne til multiplikation i urinflaskerne.

Urin fra Lokalitet 2 blev opbevaret i 8 måneder i laboratoriet. Karakterisering af ialt 22 bakterieisolater efter 5-8 måneders opbevaring af urinen ved forskellige temperaturer påviste forekomst af E. faecium og E. gallinarum. Typning af en række E. faecium stammer viste tre forskellige PFGE typer, mens alle 12 undersøgte E. gallinarum stammer havde en identisk PFGE type F. Der forekom således flere forskellige E. faecium stammer og en identisk E. gallinarum stamme som kunne overleve længere tids lagring i urin og/eller havde evnen til at kunne multiplicerer.

Resultaterne af undersøgelsen stiller store spørgsmålstegn ved anvendeligheden af enterokokker som indikator på hygiejnisk kvalitet af opbevaret urin fra mennesker. En god mikrobiel hygiejneindikator bakterie skal opfylde flere forhold, herunder at reduktionen i dens antal svarer til en antalsreduktion af de smitstoffer (eksempelvis Campylobacter og Salmonella), som den skal indikerer en eventuel tilstedeværelse af. En god indikatorbakterie må normalt heller ikke kunne udvise vækst. Det bør derfor overvejes at anvende andre bakterielle indikatorer end enterokokker til fastlæggelse af den bakteriologiske kvalitet af lagret urin. E. coli har i en tidligere undersøgelse vist korte overlevelsestider i lagret urin svarende til en række vigtige bakterielle smitstoffer (1-2 måneder), herunder Shigella spp (Dalsgaard og Tarnow, 2001). Det bør derfor overvejes nærmere at anvende E. coli som indikator på bakteriologisk kvalitet af opbevaret urin fra mennesker.

5.2 Projekt 2 Parasitologi

I dette projekt blev C. parvum benyttet som indikator på protozoers overlevelse i urin fra mennesker. Infektioner med protozoer, hvoraf flere kan smitte fra dyr til mennesker (såkaldte zoonoser), er blevet observeret stadig hyppigere i de seneste år og begrænser sig ikke kun til udviklingslande med ringe sanitære forhold, men forekommer ligeledes i den industrialiserede del af verden, med store udbrud af diarre forårsaget af protozoerne Cryptosporidium, Cyclospora og Giardia (Slifko et al., 2000). I Danmark diagnosticeres infektioner med Giardia hyppigere end infektioner med Cryptosporidium, mens der ikke har været registreret diarrétilfælde forårsaget af Cyclospora. Langt de fleste af disse infektioner er erhvervet i udlandet, men eftersom cryptosporidiose er en relativ almindelig infektion i kvægbruget (Anonymous, 2002) er der en potentiel risiko for infektioner via kvæg.

C. parvum er en egnet indikator for protozoers overlevelse i miljøet, herunder eksempelvis i vand eller i urin, da C. parvum er mere resistent overfor miljøpåvirkninger, såsom pH, ammoniak og temperatur end Giardia (Olson et al., 1999).

Undersøgelser udført for Miljøstyrelsen i 2001 (Dalsgaard og Tarnow, 2001) viste, at et lille antal fundne æg af C. parvum tilsyneladende kunne overleve adskillige måneder i urinlagringstanke. Dette fund var overraskende, idet svenske undersøgelser har vist, at æg af C. parvum maksimalt overlever 2 måneder i urin fra mennesker, når urinen lagres ved 4ºC (Höglund og Stenström, 1999). Undersøgelserne beskrevet i denne rapport bekræfter de svenske undersøgelser, idet en overlevelse på under 2 måneder blev fundet for æg lagret ved 4ºC i urin fra mennesker. I modsætning til de tidligere svenske undersøgelser blev det endvidere fastlagt at æg med en viabilitet <2% ikke kunne inficerer mus. C. parvum æg lagret i urin i 2 måneder syntes således ikke at være infektive, herunder for mennesker.

En mulig forklaring på uoverensstemmelserne i resultater fra de tidligere danske undersøgelser (Dalsgaard og Tarnow, 2001) og resultaterne i denne rapport, kunne være, at der skete en fækal forurening efter de undersøgte urintanke blev lukket. Hvis denne forklaring er korrekt, understreger det vigtigheden af at have et holdbart og tæt urinlagringssystem. Endelig var resultaterne i de tidligere undersøgelser baseret på et meget lille antal æg. Forudsat at der ikke sker en efterfølgende fækal forurening af den lagrede urin viser denne rapports og de svenske resultater, at urin kan anses at være fri for levende og infektive protozoæg efter ca. 2 måneders ved lagringstemperaturer >4ºC.

Med hensyn til overlevelse af andre parasitter i urin fra mennesker tyder svenske undersøgelser på en relativ god overlevelse af Ascaris suum æg (Höglund et al., 1998). Ascaris æg bruges ofte som model på parasitægs overlevelse i miljøet, da disse æg udviser en meget stor resistens overfor ydre miljøpåvirkninger. Det vil kræve yderligere undersøgelser at give retningslinier for lagringstid af urin med henblik på drab af Ascaris æg. Ascaris æg er markant større end protozoæg, hvilket medfører at førstnævnte vil udvise en højere grad af sedimentering og derfor primært vil forekomme i urinens sediment.

I denne rapport er undersøgelserne foretaget ved tre forskellige lagringstemperaturer; 4, 10 og 20ºC. Adskillige undersøgelser har vist, at Cryptosporidium overlevelse i forskellige medier (ferskvand, saltvand, fækalier og urin) er stærkt temperaturafhængig, idet æggene overlever længst tid ved lavere temperaturer, med 4ºC som optimum temperatur for overlevelse (Robertson et al., 1992; Fayer et al., 1998; Olson et al., 1999, Höglund og Stenström, 1999; Freire-Santos et al., 2000). Således fandtes der også i denne undersøgelse en sammenhæng mellem temperatur og overlevelse af æg i urin fra mennesker, med den længste overlevelse (under 2 måneder) ved 4ºC.

pH værdier og ammoniumkoncentrationer i urin udtaget fra de to opsamlingstanke viste sig at være yderst stabile i løbet af forsøgsperioden, hvilket indikerer, at der har været et minimalt udslip af ammoniak ved udtagning af prøver fra glasflaskerne med urin. Det var derfor ikke muligt at lave en egentlig vurdering af pH og ammonium/ammoniaks indflydelse på æggenes overlevelse. Den længere overlevelse af æg i kontrolopløsningen af fosfatbuffer tyder imidlertid på en særlig effekt af urinen på æggenes overlevelse. Ammonium/ammoniak har sandsynligvis en vigtig negativ effekt på protozoægs overlevelse i urin. Dette er beskrevet eller antydet i andre lignende undersøgelser, hvor man fandt at pH alene ikke kunne forklare en øget dødelighed af æg (Jenkins et al., 1998; Höglund og Stenström, 1999).

Der fandtes i vore undersøgelser en god korrelation mellem viabilitetsassayet (DAPI/PI cellefarvning) og podningsforsøgene i mus. Resultaterne viste, at når æggene af C. parvum var klassificeret som døde (<2% levende æg) så kunne disse ikke inficerer (smitte) mus. Undersøgelserne viser således, at fastlæggelse af viabilitet var fuldt tilstrækkeligt til fastlæggelse af æggenes infektivitet. Der udvikles endvidere i øjeblikket cellebaserede assays til infektivitetsbestemmelse. Disse cellebaserede assays er ofte mere præcise end musemodellen, idet man i en musemodel altid vil have en vis variation mellem dyrene. Eksempelvis var der i denne rapports undersøgelser enkelte mus i den positive kontrolgruppe der ikke var modtagelige overfor infektion, selvom de er blevet podet med en tilstrækkelig stor dosis af æg. Sådanne variationer er meget begrænsede i celleassays.

I vore undersøgelser blev der brugt C. parvum æg fra kvæg, da det ikke er muligt at opformere og skaffe tilstrækkelig antal C. parvum æg fra mennesker. Det kan diskuteres om overlevelse og infektivitetsundersøgelser af æg fra dyr er gode modeller for æg isoleret fra mennesker. Umiddelbart vil æg med forskellig oprindelse forventes at have en sammenlignelig resistens overfor miljøpåvirkninger, hvorimod der i podningsforsøg muligvis kan være forskelle i infektivitet (Fayer et al., 2000). Disse forhold er således endnu et argument for i fremtiden at benytte cellebaserede assays til bestemmelse af infektivitet, især cellelinier fra menneskevæv. Disse forhold ændrer dog ikke den generelle konklusion, at urin kan anses at være fri for levende og infektive protozoæg efter ca. 2 måneders ved lagringstemperaturer >4ºC.

Semipermeable kapsler har tidligere været brugt til undersøgelse af C. parvum ægs overlevelse i jord og dyregødning (Jenkins et al., 1999), men så vidt det vides ikke til undersøgelser af overlevelse af C. parvum æg i urin fra mennesker. Kapslerne tillod en tilstrækkelig høj koncentration af æg og det var relativt nemt at oprense æg fra kapslerne. Kapslerne fungerede således på alle måder tilfredsstillende.