Miljøprojekt, 934 – Hurtigmetoder til screening for coliforme bakterier og E .coli i drikkevand

Hurtigmetoder til screening for coliforme bakterier og E .coli i drikkevand

2 Materialer og metoder

2.1 Valgte metoder
2.2 Analyseprincipper
2.3 Prøvemateriale
2.4 Fremgangsmåde
2.5 Analyseomfang

2.1 Valgte metoder

Som kvalitative metoder (påvist/ikke påvist i 100 ml vand) er der valgt de simple, kommercielt tilgængelige metoder Colilert®-18, Colilert® og Readycult® overfor referencemetoden DS 2255 modificeret med direkte inkubering ved 44 °C som supplement til inkubering ved 37 °C.

Valget er baseret på kommercielle metoder, der er tilgængelige via danske leverandører og som har internationale godkendelser. Det skal bemærkes, at andre producenter / leverandører, der ønsker en godkendelse af deres metoder, kan indsende anmodning herom til Miljøstyrelsen, såfremt metoden dokumenteres at være ligeværdig eller bedre end den gældende nationale referencemetode, jf. Kvalitetsbekendtgørelsen.

De valgte kommercielle metoder er godkendte af EPA (US Environmental Protection Agency).

Med henblik på at godkende en metode med lavere detektionsgrænse – og samtidig også gerne hurtigere end referencemetoden – er undersøgt hhv. 500 ml prøve og 1000 ml prøve. Til dette formål er foretaget inkubering af membranfilter/-re fra filtrering af 500 ml hhv. 1000 ml vand. Som referencemetode hertil er anvendt inkubering af filtre i 50 ml enkeltstyrke MacConkey-bouillon ved 37 °C samt direkte ved 44 °C. Det skal bemærkes, at en direkte inkubering ved 44 °C er en modifikation fra DS 2255, hvor der er foreskrevet indledende inkubering ved 37 °C. Med direkte inkubering ved 44 °C kan der være en risiko for at stressede E. coli ikke kan vokse på grund af kombinationen af selektivt substrat og inkubation tæt på bakteriens maksimumtemperatur.

2.2 Analyseprincipper

For såvel Colilert®-systemerne som ReadyCULT® er der tale om de samme enzymatisk baserede analyseteknikker.

Coliforme bakterier producerer enzymet β-galactosidase og kan derved omsætte substratet o-nitrophenyl (såkaldt ONPG positive) og substratet 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (såkaldt X-Gal positive).

Ved omsætning af det farveløse o-nitrophenyl dannes den gule forbindelse o-nitrophenol. ONPG positive bakterier kan således påvises ved gulfarvning.

Ved omsætning af det farveløse 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (chromogent substrat) dannes en blå-grøn forbindelse. X-Gal positive bakterier kan således påvises ved blå-grøn farvning.

E. coli producerer – med få undtagelser - desuden enzymet β-glucuronidase og kan derved omsatte 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (såkaldt MUG positive).

Ved omsætning af det farveløse 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide dannes en fluorescerende forbindelse 4-methyl-umbelliferone. MUG positive bakterier kan således påvises ved fluorescens under UV-lys (365 – 366 nm).

I Colilert®-systemerne er ONPG og MUG de væsentligste kulstof-kilder, der derfor vil blive omsat, såfremt der er coliforme bakterier hhv. E. coli tilstede i prøven. Positive prøver bliver således gule hhv. fluorescerende.

I ReadyCULT® er X-Gal og MUG tilsvarende de væsentligste kulstof-kilder. Positive prøver bliver således blå-grønne hhv. fluorescerende. ReadyCULT® foreskriver, at fluorescerende prøver skal verificeres yderligere ved test for indolproduktion (positiv hos E. coli), hvilket gøres ved tilsætning af Kovacs' reagens og påvisning af en rødfarvning.

2.3 Prøvemateriale

Der er udtaget vandprøver fra ledningsnettet i henhold til DS 2250. Dog er prøverne udtaget i sterile 5 liter flasker og transporteret til laboratoriet uden køl, men analyseret indenfor 24 timer fra prøvetagning. Det er vurderet, at køl under transport ikke er nødvendig til nærværende undersøgelse. Følgefloraen kan evt. blive lidt kraftigere, hvilket da blot er at betragte som en "worst case" situation i relation til at påvise coliforme bakterier og E. coli. På grund af de store volumener, der er nødvendige for hver prøve (24 – 27,5 liter), er 5 liters flaskerne at betragte som delprøver, der vurderes at have samme homogenitet som én stor prøve.

Prøverne er udtaget fordelt over landet som angivet i tabel 1. Af hensyn til omfanget af undersøgelsen blev det valgt, at kun halvdelen af prøverne blev udsat for analyseprogrammet angivet i tabel 1 under prøvenr. 1 - 5 og resten af prøverne for analyseprogrammet nævnt i tabel 1 vedrørende prøve 6 - 10.

For podning af prøve 1 – 5 samt for alle positive kontroller er anvendt E. coli (ATCC 8739 i form af Quanti-Cult® fra Oxoid) i niveauet 10 – 100 cfu/prøve (dvs. pr. 100 ml, 500 ml eller 1000 ml vand).

For podning af prøve 6 – 10 er anvendt Aeromonas hydrophila (CCUG 25940) , Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (CCUG 28450) og Citrobacter freundii (CCUG 418 T). Der blev tilstræbt et podeniveau på 10 – 100 cfu/prøve, dog gerne i den lave ende i lighed med naturlige prøver (inokulum: 0,1 ml af en passende fortynding i salt-pepton-vand i prøver á 100 ml eller 1000 ml). Niveauet kunne dog ikke holdes i alle prøver (se "Resultater"). Aeromonas er valgt som non-coliform bakterie, Klebsiella som coliform bakterie og Citrobacter som en "grænseorganisme", idet den er sent laktoseforgærende og dermed typisk giver sene reaktion ved undersøgelse for coliforme bakterier i DS 2255.

Som negative kontroller er anvendt sterilt (autoklaveret) drikkevand.

Tabel 1: Oversigt over vandprøver og prøveprogram.

Prøvenr.	Udtagningssted	Vandforsyning	Analyseprogram
1	Frydendalsvej 30, 1809 Frb. C	Frederiksberg Forsyning	Analyseret 100, 500 og 1000 ml. Upodede prøver samt prøver podet med E. coli.
2	Holsbjergvej 42, 2620 Albertslund	Albertslund Kommune, Vandforsyningen
3	Robert Holms Vej 3, 8700 Horsens	Horsens Kommune, Vandforsyningen
4	Midtsjælland	Privat boring A
5	Midtsjælland	Privat boring B
6	Boghvedevej 34, 8900 Randers	Energi Randers Vand	Analyseret 100 ml og 1000 ml. Upodede prøver samt prøver podet med enten Aeromonas hydrophila, Klebsiella pneumoniae eller Citrobacter freundii.
7	Klostermarken 10, 8800 Viborg	Viborg Vand A/S
8	Agern Allé 11, 2970 Hørsholm	Hørsholm Kommunale Vandforsyning
9	Lille Tornbjerg Vej 24a, 5220 Odense SØ	Odense Vandselskab
10	Ollerupvej 8, 9220 Aalborg Ø	Aalborg Kommunes Vandforsyning

2.4 Fremgangsmåde

Testkulturerne blev opformeret i BHI-bouillon (non-selektiv næringsbouillon, Difco 0037) ved 37 °C natten over. Til E. coli blev dog anvendt QuantiCult® som nævnt tidligere.

Podeniveauer blev bestemt ved udsæd af inokulum på TSA (non-selektiv næringsagar, Merck 1.05458), 37 °C i 24 og 48 timer. For bestemmelse af E. coli blev suppleret med tælling på RVG (selektiv agar til bestemmelse af coliforme bakterier, Oxoid CM 107).

Nedenfor er i afsnittene 2.4.1 – 2.4.4 angivet de analyseforskrifter, der er anvendt under arbejdet og som vil være gældende ved brug af metoderne.

2.4.1 Colilert®-18:

Udtag 100 ml vand i steril beholder, der ikke må være fluorescerende i sig selv (her er anvendt éngangsbeholdere fra Colilert®). I de tilfælde, hvor prøvemængden skal være 500 ml eller 1000 ml filtreres vandet først (0,45 μm Cellulose Nitrate Filter) og filtrene tilsættes til 100 ml sterilt vand i beholderen.

Tilsæt en portion Colilert®-18 pulver (fra én blister) til vandet. Ryst beholderen til pulveret er opløst.

For podede prøver tilsættes relevant bakteriekultur.

Opvarm prøven til 33 - 38 °C ved placering i 35 °C-vandbad i 20 minutter eller i 44 °C-vandbad i 7 – 10 minutter.

Inkubér ved 35.0 0.5 °C til i alt 18 – 22 timer.

Coliforme:	Gulfarvning i samme grad som standarden eller kraftigere.
E. coli:	Positiv for coliform reaktionen og fluorescerende ved 365 nm i samme grad som standarden eller kraftigere.

Positive fund før 18 timer og negative fund efter 22 timer er også er valide.

Vand indeholdende klor kan give et blåt lys ved tilsætning af pulveret. Såfremt en sådan blåfarvning ses kan analysen ikke anvendes.

2.4.2 Colilert®:

Tilsæt Colilert® pulver fra én blister til vandet. Ryst beholderen til pulveret er opløst.

For podede prøver tilsættes relevant bakteriekultur.

Inkubér ved 35.0 ± 0.5 °C i 24 timer.

Coliforme:	Gulfarvning i samme grad som standarden eller kraftigere.
E. coli:	Positiv for coliform reaktionen og fluorescerende ved 365 nm i samme grad som standarden eller kraftigere.

Positive fund før 24 timer og negative fund efter 24 timer er også valide.

Vand indeholdende klor kan give et blåt lys ved tilsætning af pulveret. Såfremt en sådan blåfarvning ses kan analysen ikke anvendes.

2.4.3 Readycult®:

Udtag 100 ml vand i steril beholder (100 – 250 ml beholder, der ikke må være fluorescerende i sig selv). I de tilfælde, hvor prøvemængden skal være 500 ml eller 1000 ml filtreres vandet først (0,45 μm Cellulose Nitrate Filter) og filtrene tilsættes til 100 ml sterilt vand i beholderen.

Tilsæt ReadyCULT® pulver fra én blister til vandet. Ryst beholderen til pulveret er opløst.

For podede prøver tilsættes relevant bakteriekultur.

Inkubér ved 35 - 37 °C i 18 – 24 timer.

Coliforme:	Ethvert farveomslag til blå-grøn uanset, at det kun ses i dele af bouillonen. Negative prøver forbliver uændrede, dvs. svagt gule.
E. coli:	Lys blå fluorescens i UV-lys. Positive skal konfirmeres ved tilsætning af Kovacs' reagens.

Tilsætning af 2.5 ml Kovacs' reagens til evt. fluorescerende prøver, hvorefter en rødfarvning bekræfter indoldannelse.

2.4.4 Modificeret DS 2255

Udtag 100 ml vand og fordel i 2 x 50 ml dobbeltstyrke MacConkey bouillon med Durham-rør (jf DS 2255)

eller

Membranfiltrér (0,45 μm Cellulose Nitrate Filter) 500 ml eller 1000 ml og placér filter/-re i 50 ml enkeltstyrke MacConkey bouillon med Durham-rør (jf DS 2255).

For podede prøver tilsættes relevant bakteriekultur.

Inkubér ved 37 °C (luftinkubator) eller 44 °C (vandbad) i 24 hhv. 48 timer.

Coliforme:	Luft i Durham-rør kombineret med enhver grad af gulfarvning af bouillonen ved 37 °C som beskrevet i DS 2255.
E. coli:	Luft i Durham-rør kombineret med enhver grad af gulfarvning af bouillonen ved 44 °C. Positive skal konfirmeres ved test for indolproduktion (se næste trin).

44 °C prøver med luft og gulfarvning subkultiveres i tryptonvand og testes efter endt inkubering ved tilsætning af Kovacs' reagens, hvorefter en rødfarvning bekræfter indoldannelse. Dette trin foretages i henhold til DS 2255.

2.5 Analyseomfang

For alle ikke-podede prøver er foretaget dobbeltbestemmelse, mens alle podede prøver er analyseret som enkeltbestemmelser.

Analyseomfanget er mere detaljeret beskrevet i bilag A.