Miljøprojekt, 934 – Hurtigmetoder til screening for coliforme bakterier og E .coli i drikkevand

Hurtigmetoder til screening for coliforme bakterier og E .coli i drikkevand

4 Diskussion

Analyserne af de naturlige prøver viste, at to af de ti prøver (nr. 4 og 5) indeholdt E. coli, hvilket blev påvist med samtlige metoder og uanset prøvevolumen og dermed mængde af følgeflora. Begge de positive prøver var udtaget fra private boringer.

Syv af de resterende otte prøver blev fundet negative i alle analyser, mens én prøve (nr. 3) blev fundet positiv med de tre kommercielle metoder – men ikke i den modificerede DS 2255 - ved analyse af 100 ml vand. Disse resultater tyder på tilstedeværelse af bakterier, der ved påvisning af β-galactosidase findes positive, men som ikke er lactoseforgærende med luftproduktion. Der er således tale om to forskellige definitioner af coliforme bakterier i de anvendte metoder – om end de ofte giver ens resultat - i lighed med hvad Schets et al. (2002) beskriver. Alternativt kan forklaringen være, at MacConkey-bouillon virker mere selektivt på coliforme bakterier end substraterne i de kommercielle kits.

For prøve 3 er påvisningen i prøver med 500 ml hhv. 1000 ml vandprøve lidt svingende, hvilket kan skyldes påvirkning fra følgefloraen og dermed en uforudsigelig balance mellem positiv organisme og følgeflora.

Der er ikke ved analyse af de naturlige prøver i mængder på 500 ml vand og 1000 ml vand fundet flere positive prøver end ved analyse med 100 ml vand, hvilket alene kan skyldes, at der ikke har været coliforme bakterier tilstede – selv i de større volumener.

En vurdering af, hvorvidt den øgede mængde følgeflora som resultat af øget prøvevolumen vil kunne forstyrre detektionen af coliforme bakterier, herunder E. coli, viser at de øgede volumener ikke i nogen tilfælde har ført til reduceret påvisning. Tværtimod ses i tabel 6 for Citrobacter, at der generelt påvises lidt flere positive prøver i 1000 ml prøverne i forhold til i 100 ml prøverne. Dette forhold kan enten forklares ved Citrobacters status som "grænseorganisme" i forhold til coliforme bakterier (da den er sent laktoseforgærende), de svingende podeniveauer eller det forhold, at der ved en kombination af øget volumen og podning nås en detektionsgrænse, der ikke blev opnået med kun 100 ml vandprøve.

Fremgangsmåden med direkte inkubering af MacConkey-bouillon ved 44 °C er ikke acceptabel i forhold til DS 2255, da risikoen for at hæmme eventuelt stressede E. coli med den samtidige anvendelse af selektivt substrat og inkubering ved maksimal (ikke optimal) temperatur. Den direkte inkubering ved 44 °C har ikke påvirket påvisningen af E. coli i negativ retning i nærværende undersøgelse (se tabel 2 og 3), men talmaterialet er for småt til at drage mere generelle konklusioner. En direkte inkubering ved 44 °C parallelt med inkubering ved 37 °C vil dog kunne spare samlet inkuberingstid, der kan blive på under ét døgn for de hurtigst voksende E. coli. Fremgangsmåden kan anvendes supplerende, såfremt man holder sig for øje, at positive prøver er positive, hvorimod negative prøver kan være falsk negative og skal afvente 37 °C-resultatet og eventuel subkultivering herfra.

Schets et al. (2002) beskriver en sammenligning af den angivne metode i EU's drikkevandsdirektiv (Lactose TTC agar , ISO 9308-1) med en række andre metoder, herunder den kvantitative Colilert®-18. Schets et al. konkluderer, at Colilert-18 er et anvendeligt alternativ til påvisning af coliforme bakterier – dog påvises flere coliforme bakterier i form af et bredere spektrum af coliforme. Schets et al. konkluderer derimod, at Colilert-18 ikke er egnet til E. coli idet metoden påviser færre E. coli og i nogle tilfælde (11% af prøverne) er der tale om falsk negative prøver. Problemet her kan dog være, at definitionerne af E. coli ikke er identiske i metoderne, idet der synes at være en risiko for, at visse indolpositive regnes som E. coli i EU-metoden uden det er kendt, om de forgærer lactose med luftproduktion ved 44 °C. Vurderet ud fra de tre deltagende laboratoriers fund synes Colilert-18 dog kun at give lave gennemsnitlige fund på det ene af de tre laboratorier. Endelig er en vigtig konklusion hos Schets et al., at EU referencemetoden ikke findes optimal, da den mangler selektivitet og E. coli derved kan overvokses af ledsageflora.

Med et tilstrækkeligt antal prøver, vil der altid kunne påvises forskelle i resultater ved brug af forskellige bakteriologiske metoder/principper fordi følgeflora og stress-niveau af de efterspurgte bakterier varierer og i forskellig grad er påvirkelige af metodernes selektive og indikative principper.

Definitionen på coliforme bakterier og gruppens afgrænsning har ofte været drøftet – senest i forbindelse med problemer med DS 2255 (Jeppesen & Bagge, 2002) og fx organismer som Aeromonas hydrophila (non-coliforme) og Citrobacter (sent lactoseforgærende) har givet anledning til afgrænsningsproblemer.

For mikrobiologiske metoder vil resultatet i en vis udstrækning være metodeafhængigt og for en gruppe af bakterier som de coliforme er det næppe sandsynligt at finde metoder, der er fuldt ligeværdige, idet forskelle i definitioner, i forekomst af grænseorganismer – som nævnt i afsnittet ovenfor – samt forskelle i ledsageflora vil påvirke resultaterne.

Set i forhold til den overordnede problematik, der drejer sig om rent drikkevand contra forurenet dansk drikkevand, hurtig reaktionsevne og kildeopsporing i forbindelse med forureningssager, vurderes det at være af stor værdi, at kunne anvende hurtigere metoder. De afprøvede, hurtige, kommercielle metoder reagerer ikke positivt på en række almindelige, rene drikkevandsprøver svarende til blindprøver (prøverne 1 –2 og 6 – 10). Når der derfor ses positive reaktioner i disse metoder må det således ses som udtryk for atypiske fund i det danske drikkevand.

De afprøvede kommercielle metoder er principielt ens, idet de er baseret på detektion af de samme enzymsystemer, som nærmere beskrevet i afsnit 2.2. Der er en række (mindre) forskelle mellem de afprøvede kommercielle metoder i form af: inkuberingstid, behov for verifikation, tydelighed i aflæsningen, pris mm.

Der findes nogle få non-coliforme, der kan omsætte MUG og dermed reagere som coliforme bakterier med de testede metodeprincipper. Jf forhandlerne skulle disse bakterier dog være undertrykt af de selektive principper i testene. Det bemærkes, at metoderne ikke påviser MUG-negative E. coli til forskel fra, hvad angives for Colitag-metoden®, der forhandles fra Holland (ikke afprøvet i nærværende undersøgelse). På baggrund af publicerede metodesammenligninger vurderes det dog, at MUG-negative E. coli ikke har nogen signifikant betydning for resultaterne.

I den udstrækning metoderne anvendes af ikke-trænede personer, er det vigtigt at være meget opmærksom på risikoen for falsk positive fund pga. aflæsningerne såvel som krydsforureninger. Selv helt lavgradige forureninger af vandprøven under udførelse af analysen fx pga. berøring af låg eller flaskemunding med hænderne eller pga. snavsede omgivelser kan resultere i falsk positive fund og dermed mistanke om en større forurening af drikkevandet.

Afprøvningen viste, at man med anvendelse af et større volumen vandprøve kan øge følsomheden/sænke detektionsgrænsen og dermed forbedre bestemmelsen af coliforme bakterier og E. coli i dansk drikkevand, idet følgefloraen fra det større volumen ikke forstyrrer detektionen. Der kan naturligvis være tale om vandprøver, der er så kraftigt forurenede, at følgefloraen kan være et problem, men i de tilfælde må det antages, at kimtal 22 °C og/eller kimtal 37 °C vil være så høje, at det i sig selv vil føre til en opfølgende reaktion.

Med anvendelse af metoder med lavere detektionsgrænse som led i vandforsyningernes egen driftskontrol kan vandforsyningerne få oplysninger om, at vandet indeholder organismer, der reelt "ikke må påvises" (fx påvisning af coliforme i 1000 ml vand, men ikke i de foreskrevne 100 ml – jf. Drikkevandsbekendtgørelsen). Derfor er Miljøstyrelsen i gang med at revurdere holdningen til positive fund af coliforme bakterier, hvorimod fund af E. coli fortsat skal betragtes med samme alvor som i dag på grund af sin tætte forbindelse til fækal forurening (Bagge, 2004).