| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Virkningsmekanismer for neurotoksisk effekt af mangan og kombinationseffekt af mangan og chlorpyrifos og maneb

3 Undersøgelsesdesign

• 3.1 Oversigt over projektets undersøgelser
• 3.2 Manganundersøgelser
  • Præliminære undersøgelser med dosering med mangandioxid
  • Dose-range undersøgelsen
  • Supplerende undersøgelser med højere doser manganklorid og supplement i drikkevand
• 3.3 Chlorpyrifosundersøgelser
  • Præliminær undersøgelse
  • Dose-range undersøgelsen
• 3.4 Manebundersøgelser
  • Præliminær undersøgelse
  • Dose-range undersøgelsen
• 3.5 Kombinationsundersøgelser
  • Præliminær kombinationsundersøgelse
  • Kombinationsundersøgelsen

3.1 Oversigt over projektets undersøgelser

Oversigten viser et flow-diagram over projektets undersøgelser. I en række præliminære studier blev det undersøgt om dyrerne kunne tåle dosering med mangandioxid, manganklorid, chlorpyrifos, maneb og den valgte kombinationsbehandling. Det blev undersøgt om speciering og doseringslængde af mangansalte havde betydning for effekter på de udvalgte neurokemiske parametre og for deponering af mangan regionalt i hjernen. For chlorpyrifos’ og manebs vedkommende blev der gennemført dose-range undersøgelser, som anvendtes som basis for valg af doser i kombinationsundersøgelsen.

Klik her for at se illustration over projektets undersøgelser

3.2 Manganundersøgelser

Der valgtes intraperitoneal injektion af mangansalte for at omgå de homeostatiske mekanismer, som regulerer/begrænser absorptionen fra mave-tarmkanalen og fordi subkutan injektion kun medfører ringe absorption og tillige har stor lokalirriterende effekt ved injektionsstedet. Herudover har intraperitonal injektion vist sig at være en relevant, alternativ doseringsvej til inhalationsdosering (ATSDR 2000).

Præliminære undersøgelser med dosering med mangandioxid

Der er foretaget omfattende toksikokinetiske undersøgelser af dosering med MnO₂ (Roels et al. 1997). I disse var dosis 1,22 mg mangan/kg legemsvægt (som mangan i MnO₂) svarende til 1,93 mg MnO₂/kg legemsvægt. Denne dosering blev valgt som udgangspunkt for mangandosering.

Daglig intraperitoneal dosering i 7 dage med kommercielt mangandioxid: I første undersøgelse blev det studeret, hvorledes forskellige doser kommercielt tilgængeligt mangandioxid doseret dagligt intraperitonealt gennem 1 uge klinisk påvirkede rotterne. Dette var nødvendigt for at kunne fastsætte, hvilke dosis-muligheder der var for dosering af længere varighed.

Der blev foretaget intraperitoneal dosering af Wistar hanrotter hver dag i 7 dage med tre forskellige MnO₂ doser (1,22, 3,0 eller 5,0 mg mangan/kg legemsvægt). Der anvendtes kommercielt tilgængeligt mangandioxid (Sigma, M3138). Der var 6 dyr per gruppe.

Der blev ikke foretaget nogen kemiske eller neurokemiske analyser.

Intraperitoneal dosering i 4 uger med fintkornet mangandioxid: Denne præliminære dose-range undersøgelse blev gennemført som et 4 ugers intraperitonealt doseringsforsøg ved dosering med 1,22 mg mangan/kg legemsvægt een eller to gange/uge eller med 3,0 mg/kg legemsvægt 1 gang/uge under anvendelse af en fintkornet MnO₂-præparation (Roels et al. 1997). Der var 6 dyr per gruppe.

Fra kontrolgruppens dyr blev der foretaget mikrodissektion i corpus striatum og substantia nigra og analyser for dopamin og protein heri.

Dose-range undersøgelsen

Efter disse undersøgelser blev der foretaget et andet, mere omfattende dose-range studium, hvori det undersøgtes om det var muligt at dosere med MnO₂ og MnCl₂ i 8 og 12 uger, hvilke doser som kunne anvendes, og om dette påvirkede neurokemiske parametre i corpus striatum og resthjernen, specielt dopamin koncentrationen. Herudover undersøgtes det, hvordan mangan speciering og doseringsvarighed påvirkede vævskoncentrationen af mangan i corpus striatum, resthjerne og plasma.

En supplerende gruppe doseret med 6-OHDA skulle sikre, at der kunne induceres og dokumenteres en reduceret dopamin koncentration i corpus striatum.

Det var oprindeligt planlagt at dosere med 15 mg mangan/kg legemsvægt som manganklorid, men allerede første dosering gav så alvorlige problemer for dyrene, at det blev besluttet ikke at fortsætte med denne dosis. Efter en seponeringsperiode valgtes at genstarte manganklorid doseringen med en dosis på 2,5 mg mangan/kg legemsvægt/dag. Dette forsinkede doseringen med manganklorid, og der måtte derfor fremskaffes en ekstra kontrolgruppe på 12 dyr for at få kontroldyr, som blev aflivet på samme tidspunkt og var alderssvarende med de manganklorid doserede dyr.

Dose-range undersøgelsen foregik således: Der anvendtes Sprague Dawley hanrotter. Der blev foretaget intraperitoneal dosering med fintkornet MnO₂ og med MnCl₂. Udover kontroldosering med vehikel (0,9% NaCl) blev der doseret med 1,22 mg mangan (som MnO₂)/kg legemsvægt to gange/uge i 8 og 12 uger og med 2,5 mg mangan (som MnCl₂)/kg legemsvægt/dag i 8 uger eller 12 uger. Der var 12 dyr pr. gruppe. Der blev udtaget poolet (højre plus venstre) corpus striatum og resthjerne fra alle dyr, undtagen dyrene i den supplerende 6-OHDA gruppe, hvorfra højre og venstre corpus striatum blev behandlet hver for sig.

Koncentrationen af mangan blev bestemt i corpus striatum, resthjerne og plasma. Der foretoges neurokemiske analyser i corpus striatum og resthjerne af koncentrationen af noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin og aminosyrer med signalstoffunktion (glutamat, taurin, GABA) samt af aktiviteten af acetylcholin- og butyrylcholinesterase og koncentrationen af α-synuclein og synaptophysin. Herudover blev koncentrationen af plasmaprolaktin bestemt.

Supplerende undersøgelser med højere doser manganklorid og supplement i drikkevand

I en række supplerende undersøgelser blev det forsøgt at øge manganoptagelsen ved at øge mangandosis, mangandoseringshyppighed og mangandoseringsvarighed med det formål at øge vævskoncentrationen og dermed effekten af mangan på den striatale dopaminkoncentration. Der blev doseret med manganklorid, idet det letopløselige manganklorid var bedre egnet end det tungtopløselige mangandioxid.

Efter dose-range undersøgelsen blev der foretaget supplerende undersøgelser. Hertil anvendtes to højere doser, 5,0 og 7,5 mg mangan/kg legemsvægt/dag, som hver blev doseret uden og med supplement af manganklorid (5 gram/L) via drikkevand. Der var 20 dyr/gruppe. Der blev kun foretaget kliniske observationer af disse dyr.

3.3 Chlorpyrifosundersøgelser

Oprindeligt var det planlagt at foretage undersøgelsen med chlorpyrifos som en 28 dages undersøgelse med dosering via foderet. Men da en tidligere undersøgelser udført i et andet projekt med chlorpyrifos dosering via foder gav anledning til alvorlige problemer vedrørende homogenietet og stabilitet, blev det i stedet besluttet at dosere subcutant.

Udgangspunkt herfor var en artikel, som viste reduceret AChE aktivitet i corpus striatum efter subcutan dosering med 30 mg chlorpyrifos/kg legemsvægt/uge i 4 uger (Huff et al. 2001).

Præliminær undersøgelse

Der blev udført en indledende undersøgelse for at sikre, at dyrene kunne tåle den planlagte dosering og til at specificere dosisniveauer i det senere dose-range studium. Sprague-Dawley hanrotter blev doseret med vehikel, 2,5 og 30 mg chlorpyrifos/kg legemsvægt/uge subcutant i 12 uger. Der var 4 dyr per gruppe.

Dose-range undersøgelsen

Dose-range undersøgelsen havde til formål at undersøge virkningsmekanismer for chlorpyrifos’ neurotoksiske effekt, når chlorpyrifos blev doseres alene og til at fastsætte dosis i kombinationsundersøgelsen. Sprague Dawley hanrotter blev doseret med vehikel, 2,5, 15 eller 30,0 mg chlorpyrifos/kg legemsvægt/uge subcutant. Der var 12 dyr pr. gruppe til neurokemiske undersøgelser og 12 til histopatologiske undersøgelser. Der blev udtaget poolet corpus striatum og resthjerne fra alle dyr til neurokemiske undersøgelser samt blod.

Der foretoges neurokemiske analyser i corpus striatum og resthjerne af koncentrationen af noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin og aminosyrer med signalstoffunktion (glutamat, taurin, GABA) samt af aktiviteten af acetylcholin- og butyrylcholinesterase og koncentrationen af α-synuclein og synaptophysin.

3.4 Manebundersøgelser

Oprindeligt var det planlagt at foretage dose-range undersøgelsen med maneb som en 28 dages undersøgelse ved dosering via foder. Da en tidligere undersøgelser udført i et andet projekt med mancozeb dosering via foder gav anledning til alvorlige problemer vedrørende homogenietet og stabilitet, blev det i stedet besluttet at dosere maneb subkutant.

Præliminær undersøgelse

Der blev foretaget en indledende undersøgelse for at sikre, at dyrene kunne tåle den planlagte dosering og til at specificere dosisniveauer i den endelige dose-range undersøgelse.

Det var oprindeligt planlagt at dosere med ugentlige maneb doser, som var molækvivalente med den MnCl₂ dosis, som blev fastlagt i dose-range undersøgelsen for mangan. En enkeltdosis på 11,9 mg maneb/kg legemsvægt svarer til den fastlagte daglige mangandosis på 2,5 mg manganion/kg legemsvægt. Som udgangspunkt for den ugentlige manebdosis valgtes derfor doserne 15, 30, 60 eller 120 mg/kg legemsvægt/uge subkutant. Der var 6 dyr/gruppe.

Da dyrene ikke kunne tåle disse doseringer blev kontrolgruppens 6 dyr doseret intraperitonealt med 0, 15 eller 30 mg maneb/kg legemsvægt/uge én gang om ugen i 12 uger for at undersøge om dette var et bedre doseringsregie. Denne dosering kunne dyrene tåle uden sundhedsmæssige problemer.

Dose-range undersøgelsen

Dose-range undersøgelsen med maneb havde til formål at undersøge virkningsmekanismer for manebs neurotoksiske effekt, når det blev doseret alene og til at fastsætte dosis i kombinationsundersøgelsen. Eventuelle effekter induceret af maneb skulle sammenlignes med dem, der blev induceret af mangansalt alene.

Der blev doseret intraperitonealt med 0; 7,5; 15 og 30 mg maneb/kg legemsvægt/uge i 12 uger. Der var 10 dyr pr. gruppe til mangananalyser og neurokemiske undersøgelser og 12 til histopatologiske. Der blev udtaget poolet corpus striatum og resthjerne fra alle dyr til neurokemiske undersøgelser samt blod.

Der foretoges neurokemiske analyser i corpus striatum og resthjerne af koncentrationen af noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin og aminosyrer med signalstoffunktion (glutamat, taurin, GABA) samt af aktiviteten af acetylcholinesterase og butyrylcholinesterase og koncentrationen af α-synuclein og synaptophysin. Mangan blev analyseret i poolet corpus striatum.

3.5 Kombinationsundersøgelser

Denne undersøgelse havde til formål at undersøge virkningsmekanismer for mangans, chlorpyrifos og manebs neurotoksiske effekt i relation til parkinsonisme, når de blev doseret alene og i kombination. Doseringsregimen blev valgt på basis af resulteterne i de foregående dose-range undersøgelser med mangan, chlorpyrifos og maneb doseret alene.

Præliminær kombinationsundersøgelse

Der blev udført en indledende undersøgelse for at sikre, at dyrene kunne tåle den planlagte kombinationsdosering, fordi sådan kombinationsdosering ikke er foretaget tidligere i projektet endsige beskrevet i litteraturen. Der foretoges kun klinisk observationer af dyrenes sundhedstilstand.

Kontrolgruppen blev doseret intraperitonealt med 0,9% NaCl/dag. Kombinations-gruppen blev doseret intraperitonealt med 2,5 mg Mn/kg/dag; subcutant med 15 mg chlorpyrifos/kg/uge og intraperitonealt med 10 mg maneb/kg/uge. Der blev doseret i 12 uger. Der var 10 dyr pr. gruppe.

Kombinationsundersøgelsen

Da dyrene kunne tåle denne kombinationsbehandling valgtes efter 10 ugers dosering at iværksætte kombinationsundersøgelsen med samme doser. I kombinationsundersøgelsen blev der doseret således:

Der var 10 dyr til neurokemi og mangananalyser og 10 dyr til histopatologi. Der blev udtaget poolet corpus striatum og resthjerne fra alle dyr til mangananalyser og neurokemiske analyser samt blod. Der foretoges neurokemiske analyser i corpus striatum og resthjerne af koncentrationen af noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin og aminosyrer med signalstoffunktion (glutamat, taurin, GABA) samt af aktiviteten af enzymer (acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, caspase-3, glutamatdecarboxylase) og koncentrationen af α-synuclein og synaptophysin. Herudover blev koncentrationen af plasmaprolaktin bestemt.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 August 2005, © Miljøstyrelsen.