|
Virkningsmekanismer for neurotoksisk effekt af mangan og kombinationseffekt af mangan og chlorpyrifos og maneb 5 Resultater
5.1 ManganundersøgelserPræliminære undersøgelserDaglig intraperitoneal dosering i 7 dage med kommercielt mangandioxid: Denne undersøgelse havde til formål at kontrollere om dosering påvirkede dyrens sundhedstilstand. Dosering medførte ikke sundhedsmæssige problemer vurderet udfra de daglige kliniske inspektioner af dyrerne og det forhold, at dosering ikke påvirkede dyre- eller hjernevægt på aflivningstidspunktet. Derimod blev der ved sektionen konstateret vævsreaktioner i bughulen og omkring testikler med vævsindkapsling af ikke absorberet MnO2 - mindst udtalt svarende til laveste dosis. Dette viste, at der ikke uden problemer kunne foretages daglige injektioner i 7 dage, heller ikke med laveste dosis svarende til 1,22 mg mangan/kg legemsvægt/dag. Intraperitoneal dosering i 4 uger med fintkornet mangandioxid: De daglige kliniske inspektioner af dyrerne viste ikke sundhedsmæssige problemer. Men også i denne undersøgelse blev der ved sektionen konstateret vævsreaktioner i bughule og omkring testikler med vævsindkapsling af ikke absorberet MnO2 mest udtalt ved højeste dosis (3,0 mg Mn/kg legemsvægt/uge). En og to ugentlige doseringer med 1,22 mg mangan viste også vævsreaktioner, men ved én ugentlig injektion var niveauet så acceptabelt, at der kunne fortsættes hermed i de efterfølgende undersøgelser. Det blev vurderet ud fra restmængden i bughulen, at fintkornet MnO2 lettere absorberedes end den kommercielle præparation, som anvendtes i første undersøgelse. Protein og dopaminkoncentration i vævsskiver og hele corpus striatum: Beregnes de procentvise standardafvigelser for protein- (Corpus striatum: 33,7%; Substantia nigra: 31,6%) og dopamin koncentration (Corpus striatum: 42,2%; Substantia nigra: 83,7%) i udtaget væv ses, at disse er store, specielt for dopamin koncentrationens vedkommende. Trods individuel dyr-til-dyr variation kan dette ikke være forklaringen. En sandsynligere årsag er store subregionale forskelle i dopamin koncentrationen kombineret med ikke helt reproducerbar lokalisation af vævsprøver i corpus striatum og substantia nigra trods store anstrengelser for reproducerbar udskæring af vævsskiver i metalmatrice og udstansning af væv fra skiven. Med disse store variationer vil det ikke være muligt at dokumentere små mangan-inducerede ændringer i dopamin koncentrationer i vævsskiver. I stedet blev det besluttet at udtage hele corpus striatum og foretage neurokemiske analyser heri. I en supplerende undersøgelse i 6 kontroldyr blev der udtaget og vejet corpus striatum til efterfølgende dopaminanalyse. Den procentvise standardafvigelse i dopamin koncentrationen var 6,4 %, hvilket var meget tilfredsstillende. Med denne lave standardafvigelse vil det være muligt at dokumentere små manganinducerede ænringer i dopamin koncentrationer i corpus striatum. Derfor udtages corpus striatum i de efterfølgende undersø-gelser. Men ved analyser i hele corpus striatum reduceres ”opløsningsevnen”, fordi der ikke opnås oplysninger om neurokemiske ændringer i specifikke, små lokalisationer. Uanset hvor lille en prøve som udtages, vil der på mikroskopisk niveau altid være heterogenitet i neurokemiske parametre. Dette kan til dels minimeres ved at foretage neurokemiske analyser i mikroskopiske snit. Her kunne f.eks. in situ hybridisering og fluorescensmikroskopi bruges. Fluoroscensmikroskopi kan anvendes til visualisering af f.eks. signalstof koncentrationer, men herved bliver kvantificeringen og reproducerbarheden for lokalisation i snit fra forskellige hjerner det sårbare punkt. Dose-range undersøgelsenVurderet udfra de daglige kliniske inspektioner af dyrerne i deres bure medførte ingen dosering sundhedsmæssige problemer. Men på trods af, at der nu blev anvendt fintkornet MnO2, blev der alligevel ved sektionen igen konstateret vævsreaktioner i bughulen og omkring testikler med vævsindkapsling af ikke absorberet MnO2 i en udstrækning, som komprommiterede dosering med dette salt. Der var også ophobning af MnO2–rester i bughulen, specielt de lavere liggende områder: tunica albicans omkring peritoneums afgrænsning af bughulen ind mod testiklerne. Tabel 1 viser vægte af dyr, højre og venstre corpus striatum, beregnet poolet corpus striatum (beregnet sum af højre og venstre) samt resthjerne. Det skal poienteres, at højre og venstre halvdel af corpus striatum blev vejet og poolet for alle holds vedkommende, undtagen holdet doseret med 6-hydroxydopamin, da dette blev injiceret ensidigt i højre corpus striatum. Kemiske og neurokmiske undersøgelser blev således foretaget i poolet corpus striatum for alle holds vedkommende, undtagen holdet doseret med 6-hydroxydopamin, hvori analyserne foregik i højre og venstre separat. Legemsvægte: Der var fald i legemsvægt af dyr doseret med 2,5 mg mangan (som MnCl2)/kg legemsvægt/dag i 8 uger (400±36 g) og stigning i legemsvægt for dyr doseret med 6-OHDA(485±31 g) i forhold til kontroldyr (463±41 g). Der var ingen ændringer i legemsvægt af dyr doseret med MnO2 i 8 eller 12 uger (Tabel 1). Corpus striatum: Der var stigning af vægt af poolet corpus striatum fra dyr doseret med 1,22 mg mangan (som MnO2)/kg legemsvægt/uge i 8 uger (46,6±8,6 mg) og i højre (31,0±5,8 mg) og venstre corpus striatum (25,6±5,8 mg) fra dyr doseret med 6-OHDA i forhold til kontrol (Højre 21,9±5,8 mg, venstre 20,2±4,7 mg, poolet 40,9±6,2 mg) (Tabel 1). Resthjerne: Der var stigning af vægt af resthjerne fra dyr doseret med 1,22 mg mangan (som MnO2)/kg legemsvægt/uge i 8 uger(1,78±0,05 g) og efter dosering med MnCl2 i 12 uger (1,78±0,05 g) i forhold til kontrol (1,70±0,11 g) (Tabel 1). Tabel 1: Legemsvægt og vægt af corpus striatum og resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA).
Tabellen angiver gennemsnit standardafvigelse. Antallet af dyr var 24 i kontrolgruppen og 10-12 i alle andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Mangankoncentrationer: Målingen på ICP-MS (m/z 55) var næsten fri for polyatomisk interferens (40Ar15N), idet blindværdien hvori denne interferens er tilstede var lav og stabil i signalintensitet. Standardafvigelser på blindværdier af 0,32 M sukrose var så lav, at den estimerede detektionsgrænse muliggjorde påvisning af mangan i alle prøverne. I Figur 3 ses koncentrationen af mangan i corpus striatum, resthjerne og plasma. Det fremgår, at alle doseringer med MnO2 og MnCl2 øgede koncentrationen af mangan i corpus striatum, resthjerne og plasma i forhold til kontrolgruppen (Figur 3). Doseringer med MnCl2 gav generelt højere koncentrationer i corpus striatum og resthjerne og til dels i plasma end dosering med MnO2 (Figur 3). Dosering med både MnO2 og MnCl2 i 12 uger gav højere plasma mangankoncentrationer end 8 ugers dosering. Det blev antydet, at ophobningsgraden af mangan i resthjernen var af samme størrelsesorden ved dosering med MnO2 og MnCl2 taget i betragtning, at mangan doseret som MnCl2 blev doseret i ca. dobbelt så stor dosis som med MnO2. Dette var ikke så tydeligt i corpus striatum. Efter dosering med 6-OHDA faldt koncentrationen af mangan i højre corpus striatum. Der var ingen forskel med hensyn til mangankoncentrationen i resthjerne og plasma mellem kontrolholdet og holdet der blev doseret med 6-OHDA. Der var ikke forskel i mangan koncentrationen i corpus striatum (8,01±2,02 nmol/g væv) og resthjerne (6,72±0,53 nmol/g væv) fra kontroldyr. Der var heller ikke regional forskel i mangan koncentrationen i corpus striatum og resthjerne hvadenten der blev doseret med MnO2 eller MnCl2 eller om dette foregik 8 eller 12 uger (Figur 3). Der var således ingen regional opkoncentrering.
Figur 3. Koncentrationen af mangan i corpus striatum, resthjerne og plasma fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper undtagen gruppen doseret med 6-OHDA, hvor der kun vises data for højre corpus striatum. Der var 21 dyr i kontrolgruppen, 9-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer: I Figur 4 og 5 ses koncentrationen af signalstoffer i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Det var ikke muligt at måle noradrenalinkoncentrationen i corpus striatum, da denne lå under detektorens detektionsgrænse. På grund af defekt i den fryser, hvori prøver blev opbevaret før bestemmelse af 5-hydroxytryptamin koncentrationen i resthjerne, var det ikke muligt at måle denne. Figur 4 viser, at der var markant reduceret dopaminkoncentration i højre corpus striatum fra dyr doseret med 6-OHDA (2,97±5,15 nmol/g væv) i forhold til kontrolholdet (poolet striatum: 92,9±9,6 nmol/g væv). Der blev demonstreret en mindre reduktion i dopamin-koncentrationen som følge af dosering med MnCl2 i 12 uger (83,1±7,1 nmol/g væv) i forhold til kontrolholdet (poolet striatum: 92,9±9,6 nmol/g væv) (Figur 4). Dosering med MnO2 i 8 (3,070,39 nmol/g væv) og 12 uger (2,910,50 nmol/g væv) og i 12 uger med MnCl2 (2,20±0,25 nmol/g væv) ændrede 5-HT koncentrationen i poolet corpus striatum i forhold til kontroldyrs (2,58±0,40 nmol/g væv). Ensidig dosering med 6-OHDA i højre corpus striatum reducerede koncentratonen af 5-HT (1,54±0,53 nmol/g væv) i denne i forhold til kontrolholdet (poolet striatum: 2,58±0,40 nmol/g væv) (Figur 4).
Figur 4. Koncentrationen af dopamin (DA) og 5-hydroxytryptamin (5-HT) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper undtagen gruppen doseret med 6-OHDA, hvor der kun vises data for højre corpus striatum. Der var 21 dyr i kontrolgruppen, 9-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Mangandosering ændrede ikke på koncentrationen af noradrenalin og dopamin i resthjerne, hvorimod dosering med 6-OHDA markant reducerede koncentrationen af både noradrenalin (1,74±0,27 nmol/g væv) og dopamin (2,30±0,66 nmol/g væv) i forhold til kontrol (noradrenalin: 3,01±0,31 nmol/g væv; dopamin: 4,72±0,68 nmol/g væv) (Figur 5).
Figur 5. Koncentrationen af noradrenalin (NA) og dopamin (DA) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 24 dyr i kontrolgruppen, 10-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Koncentration af aminosyrer med signalfunktion: I Figur 6 og 7 ses koncentrationen af aminosyrer med signalfunktion i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Dosering med MnCl2 i 12 uger reducerede koncentrationen af taurin (11,2±1,0 nmol/g væv), glutamat(7,79±0,87 nmol/g væv) og GABA (1,44±0,23 nmol/g væv) i corpus striatum i forhold til kontrol (taurin: 16,4±5,4 nmol/g væv; glutamat: 10,3±1,5 nmol/g væv; GABA: 2,02±0,51 nmol/g væv) (Figur 6). Glutamatkoncentrationen reduceredes i højre corpus striatum (8,21±1,25 nmol/g væv) efter dosering med 6-OHDA i forhold til kontrol (poolet: 10,3±1,5 nmol/g væv). Dosering med MnCl2 i 8 uger reducerede koncentrationen taurin i resthjernen (doseret: 5,64±0,51 nmol/g væv; kontrol: 7,21±1,26 nmol/g væv), hvorimod taurinkoncentrationen i resthjerne (12,9±2,4 nmol/g væv) steg markant efter 12 ugers dosering med MnCl2 i forhold til kontrol (7,21±1,26 nmol/g væv) og var af samme størrelsesorden som den øgning 6-OHDA inducerede (13,1±1,2 nmol/g væv) (Figur 7).
Figur 6. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper undtagen gruppen doseret med 6-OHDA, hvor der kun vises data for højre corpus striatum. Der var 21 dyr i kontrolgruppen, 9-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 7. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 24 dyr i kontrolgruppen, 10-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Aktivitet af acetylcholin- og butyrylcholinesterase: I Figur 8, 9 og 10 ses aktiviteten af enzymerne AChE og BuChE i henholdsvis corpus striatum, resthjerne og plasma. Det var ikke muligt at måle BuChE aktivitet i corpus striatum, derfor er intet angivet. Der blev påvist reduceret AChE aktivitet i corpus striatum (32,0±3,1 U/g væv) (Figur 8) og resthjerne (8,43±0,24 U/g væv) (Figur 9) efter dosering med 2,5 mg mangan/kg legemsvægt/dag i 12 uge i forhold til kontrol (corpus striatum: 40,21±0,8 U/g væv; resthjerne: 9,12±0,56 U/g væv). Der var ingen effekt på AChE og BuChE aktivitet i plasma (Figur 10).
Figur 8. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper undtagen gruppen doseret med 6-OHDA, hvor der kun vises data for højre corpus striatum. Der var 21 dyr i kontrolgruppen, 9-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 9. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 24 dyr i kontrolgruppen, 10-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 10. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE) i plasma fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 24 dyr i kontrolgruppen, 10-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Kvantificering af α-synuclein, synaptophysin: Figur 11 viser typiske western blots af proteinerne actin (kontrolprotein for prøvemængde), synaptophysin og α-synuclein udført med prøvemateriale fra corus striatum.
Figur 11. Eksempel på et repræsentativt western blot af actin, synaptophysin og α-synuclein i prøver fra corpus striatum. Figuren viser, for hvert af de 3 proteiner, 24 prøver hvoraf de 3 første fra venstre er kontrolprøver (kontrolhold) i vævskoncentrationerne 2,5 µg, 5 µg og 7,5 µg protein. Resten er prøver i vævskoncentrationen 5 µg protein. I Figur 12 og 13 ses koncentrationen af hjerneproteinerne α-synuclein og synaptophysin i henholdsvis corpus striatum og resthjerne efter kvantificering af western blots. Data vises som koncentrationen i doserede dyr i procent af koncentrationen i kontroldyr. Disse to figurer viser, at mangandosering ikke ændrede koncentrationen af hverken α-synuclein eller synaptophysin i corpus striatum (Figur 12) eller resthjerne (Figur 13).
Figur 12. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA) ud fra western blots målt ved densitometri. Niveauet af aα-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper undtagen gruppen doseret med 6-OHDA, hvor der kun vises data for højre corpus striatum. Der var 21 dyr i kontrolgruppen, 9-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling.
Figur 13. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 8 eller 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), mangandioxid, manganklorid eller intracranialt ved stereotaktisk injektion (højre corpus striatum) af engangsdosis af 6-hydroxydopamin (6-OHDA) ud fra western blots målt ved densitometri. Niveauet af aα-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 24 dyr i kontrolgruppen, 10-12 i de andre grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Koncentrationen af prolaktin i plasma: Koncentrationen af plasmaprolaktin blev bestemt i kontolgruppen og den gruppe, hvori der blev påvist reduceret koncentration af dopamin i corpus striatum (2,5 mg mangan/kg legemsvægt doseret i 12 uger). Koncentrationerne var henholdsvis 100±45% og 155±78% udtrykt i procent af kontrol, det vil sige, mangandoseringen påvirkede ikke prolaktinkoncentrationen i plasma. Dosering med højere doser manganklorid og supplement i drikkevandVed sektion af dyr efter intraperitoneal dosering med MnCl2 i doser på 5,0 og 7,5 mg Mn/kg/dag med og uden supplement MnCl2 i drikkevand (5 eller 15 g/L) påvistes så alvorlige vævsskader i bughulen, at sådan dosering ikke vil kunne tolereres. Herudover øgede levertoksiciteten koncentrationen af mangan i corpus striatum (54,73±5,7 nmol/g væv, n=4) og resthjerne (36,71±6,7 nmol/g væv, n=4), til niveauer svarende til cirka en faktor to højere end ved dosering med manganklorid 2,5 mg/kg legemsvægt/dag i 12 uger (corpus striatum 21,7±5,1 nmol/g væv, n=10; resthjerne 23,9±4,8 nmol/g væv, n=10). Udover at inducere vævsskader i bughulen og levertoksicitet betyder de store procentcise spredninger i mangankoncentrationerne i hjernevæv, at højere dosering end dosering med manganklorid i doser på 2,5 mg mangan/kg legemsvægt/dag i 12 uger ikke er velegnet til studier af dosis-effekt relationer. Valg af mangandosis og -doseringslængde i kombinationsundersøgelsen Undersøgelsen viste, at der som minimum skulle doseres 12 uger intraperitonealt med 2,5 mg/kg MnCl2 for at opnå reduceret dopamin koncentration i corpus striatum, og at det også var muligt at dosere således uden alt for store vævsforandringer, hvorimod dosering væsentligt udover 12 uger vil frembyde dyreetiske problemer. Derfor blev det besluttet at dosere intraperitonealt med manganklorid i en dosis på 2,5 mg mangan/kg legemsvægt/dag i 12 uger i kombinationsundersøgelsen og at forlænge doseringen med chlorpyrifos og maneb til 12 uger i dose-range undersøgelserne. 5.2 ChlorpyrifosundersøgelserPræliminær undersøgelseDen præliminære undersøgelse med subkutan dosering af 2,5 eller 30 mg chlorpyrifos/kg legemsvægt/uge viste, at dyrene kunne tåle begge de valgte doseringer i 12 uger, selvom der var lokalirritation på injektionsstedet. Chlorpyrifos reducerede dosisrelateret aktiviteten af AChE (Kontrol: 52,2±4,7; 2,5 mg chlorpyrifos: 45,8±2,2; 30 mg chlorpyrifos: 8,23±0,86 U/g væv) og BuChE (Kontrol: 3,36±0,46; 2,5 mg chlorpyrifos: 3,12±0,28; 30 mg chlorpyrifos: 2,91±0,57 U/g væv) i corpus striatum. Der var lignende fald i aktiviteten af begge enzymer i resthjerne og plasma. Der blev ikke foretaget egentlig statistisk analyse, da der kun var 4 dyr i hvert hold. På basis af disse fund valgtes chlorpyrifos doserne 2,5; 15 og 30 mg/kg legemsvægt en gang om ugen i dose-range undersøgelsen. Dose-range undersøgelsenVurderet udfra de daglige kliniske inspektioner af dyrerne i deres bure medførte chlorpyrifos ingen sundhedsmæssige problemer. Ved sektion vistes dosisrelaterede injektionsskader af lettere grad. Herudover blev der ikke påvist makroskopiske forandring, som kunne tilskrives dosering. Vægt af dyr, hjerne og andre organer: Tabel 2 viser legemsvægte og vægte af totalhjerne, lever, nyrer, binyrer, testikler, milt og thymus. Højeste dosis reducerede nyrervægten (2,90±0,26 g) i forhold til kontrol (3,30±0,18 g) og øgede vægten af binyrer (0,058±0,010 g) i forhold til kontrol (0,050±0,008 g). Der var ingen bemærkelsesværdig effekt på vægt af andre organer. Tabel 2: Legems- og organvægte af rotter doseret subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos. Histokemi og immunhistokemi: Der blev ikke påvist histopatologiske forandringer i corpus striatum eller substantia nigra ved HE-farvning. Farvning efter apoptotiske celler ved TUNEL-farvning viste ingen tegn på apoptose i corpus striatum eller substantia nigra. Der medgives ingen histopatologiske billeder. Noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer: I Figur 14 og 15 ses koncentrationen af signalstoffer i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Der var ikke målelige mængder noradrenalin i prøverne fra corpus striatum, derfor vises ingen data. Koncentrationen af dopamin i corpus striatum var øget ved de to laveste doser (henholdsvis 128±14 nmol/g væv og 132±16 nmol/g væv) i forhold til kontrol (113±21 nmol/g væv), men ikke ved højeste dosering (Figur 14). Der var ingen effekt på 5-HT koncentrationen i corpus striatum (Figur 14). I resthjernen reducerede mellemste dosis koncentrationen af dopamin (4,81±0,59 nmol/g væv) i forhold til kontrol (5,36±0,60 nmol/g væv), hvorimod 5-HT koncentrationen i resthjernen blev øget dosisrelateret (2,94±0,25; 3,21±0,38, 3,24±0,45, nmol/g væv) i forhold til kontrol (2,45±0,35) (Figur 15).
Figur 14. Koncentrationen af dopamin (DA) og 5-hydroxytryptamin (5-HT) i corpus striatum fra rotter doseret subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 15. Koncentrationen af noradrenalin (NA), dopamin (DA) og 5-hydroxytryptamin (5-HT) i resthjerne fra rotter doseret subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Koncentration af aminosyrer med signalfunktion: I Figur 16 og 17 vises koncentrationen af aminosyrer med signalfunktion i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Der var ingen effekt af chlorpyrifos på koncentrationen af de målte aminosyrer i hverken corpus striatum (Figur 16) eller resthjerne (Figur 17).
Figur 16. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i corpus striatum fra rotter doseret subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling.
Figur 17. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i resthjerne fra rotter doseret subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Aktivitet af acetylcholin- og butyrylcholinesterase: I Figur18, 19 og 20 ses aktiviteten af enzymerne AChE og BuChE i corpus striatum, resthjerne og plasma. Det var ikke muligt at måle BuChE aktivitet i corpus striatum, da aktiviteten var under detektionsgrænsen. Der iagttoges dosisrelateret reduceret aktivitet af AChE i corpus striatum efter dosering med 15 og 30 mg chlorpyrifos/kg legemsvægt (21,0±7,7 og 12,0±4,4 U/g væv) i forhold til kontrol (50,3±5,7 U/g væv). Der var dosisrelateret reduceret aktivitet af AChE og BuChE i resthjerne (Figur 19) og plasma (Figur 20).
Figur 18. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) i corpus striatum fra rotter doseret subkutant en gang pr. uge i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 19. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE) i resthjerne fra rotter doseret subkutant en gang pr. uge i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 20. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE) i plasma fra rotter doseret subkutant en gang pr. uge i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Kvantificering af α-synuclein og synaptophysin: I Figur 21 og 22 ses koncentrationen af hjerneproteinerne α-synuclein og synaptophysin i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Data vises som koncentrationen i doserede dyr i procent af koncentrationen i kontroldyr. Disse to figurer viser, at chlorpyrifosdosering ikke ændrede koncentrationen af hverken α-synuclein eller synaptophysin i corpus striatum (Figur 21) eller resthjerne (Figur 22).
Figur 21. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i corpus striatum fra rotter doseret subkutant 1 gang pr. uge i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH) ud fra western blots målt ved densitometri. Niveauet af α-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling.
Figur 22. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i resthjerne fra rotter doseret subkutant 1 gang pr. uge i 12 uger med vehikel (kontrol, jordnøddeolie) eller chlorpyrifos (CH) ud fra western blots målt ved densitometri. Niveauet af α-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper Der var 12 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Valg af chlorpyrifos dosis i kombinationsundersøgelsenDer valgtes en subkutan dosis på 15 mg/kg lgv/uge, så der er mulighed for at se både additive og antagonistiske effekter i kombinationsundersøgelsen. 5.3 ManebundersøgelserPræliminær undersøgelseDer viste sig hurtigt så store skader på injektionsstedet, at alle maneb doserede dyr måtte aflives efter kun 4 ugers dosering. Kontroldyrene kunne godt tåle den efterfølgende intraperitoneal dosering i begge niveauer af maneb (15 og 30 mg maneb/kg legemsvægt/uge) i 4 uger. Denne dosering kan også anvendes i dose-range undersøgelsen, dog ønskes indlagt en mellemdosis for at opnå bedre dosis-response forhold og gøre det muligt at udvælge den dosis, der skal anvendes i kombinationsundersøgelsen. Dose-range undersøgelsenVurderet udfra de daglige kliniske inspektioner af dyrerne i deres bure medførte maneb ingen sundhedsmæssige problemer. Ved sektion blev der observeret alvorlige irritations- og betændelsesskader i bughulen ved dosering med 30 mg/kg legemsvægt. Ved 15 mg/kg legemsvægt var skaderne stadig markante. Ved 7,5 mg var der to dyr, der havde skader, mens resten ingen skader havde. Det vurderes, at doser meget højere end 7,5 mg maneb/kg legemsvægt ikke er mulige. Vægt af dyr, hjerne og andre organer: Tabel 3 viser legemsvægte og vægte af totalhjerne, lever, nyrer, binyrer, testikler, milt og thymus. Laveste dosis maneb øgede legemsvægt (509±64 g), hjernevægt (2,17±0,06 g) og testikelvægt (4,30±0,40 g) i forhold til kontroldyr (legemsvægt: 476±30 g; hjernevægt: 2,08±0,11 g; testikelvægt: 3,84±0,40 g), hvorimod højere dosering ingen effekt havde. Højeste dosis øgede vægten af binyrer (0,052±0,005 g) i forhold til kontrol (0,046±0,005 g). Manebdosering øgede dosisrelateret vægten af milt (1,17±0,19 g; 1,18±0,14 g; 1,22±0,14 g) i forhold til kontrol (0,98±0,10 g) (Tabel 3). Tabel 3: Legems- og organvægte af rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb. Histopatologiske undersøgelser: Der blev ikke påvist vævsforandringer i corpus striatum og substantia nigra ved HE-farvning. Der blev farvet for enzymet TH i corpus striatum og substantia nigra. Der blev ikke påvist ændringer i ekspressionen heraf. TUNEL farvning viste ingen apoptotiske celler i corpus striatum eller substantia nigra. Der medgives ingen histopatologiske billeder. Mangankoncentrationer: I Figur 23 ses koncentrationen af mangan i corpus striatum. Mangankoncentrationen i denne undersøgelses kontrolhold (11,5±3,7 nmol/g væv) (Figur 23) lå på samme niveau som for tidligere kontrolhold (8,01±2,02 nmol/g væv) (Figur 3). Dosering med maneb øgede koncentrationen af mangan i corpus striatum (Figur 23), og der var en klar dosis koncentrations sammenhæng (17,6±2,3, 20,7±5,9 og 30,4±8,7 nmol/g væv). Tidligere vistes, at der ikke var forskel på mangan koncentrationen i corpus striatum og resthjerne ved mangandoseringer (Figur 3), derfor valgtes corpus striatum som eneste målorgan for manebundersøgelsens manganmålingerne.
Figur 23. Koncentrationen af mangan i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer: I Figur 24 og 25 ses koncentrationen af signalstoffer i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Det var ikke muligt at måle koncentrationen af noradrenalin i prøverne fra corpus striatum, da den lå under apparaturets detektionsgrænse. Maneb havde ingen effekt på koncentrationen af dopamin i corpus striatum, hvorimod der iagttoges dosisrelateret øget koncentration af 5-HT i corpus striatum for 7,5, 15 og 30 mg maneb/kg/uge (3,09±0,37; 3,10±0,97 nmol; 3,20±0,70 nmol/g væv) i forhold til kontrol (2,43±0,29 nmol/g væv) (Figur 24). Manebdosering påvirkede ikke noradrenalin eller dopamin koncentrationen i resthjernen, hvorimod alle tre doses øgede koncentrationen af 5-HT (2,38±0,18; 2,42±0,24 nmol; 2,36±0,27 nmol/g væv) i resthjernen i forhold til kontrol (2,05±0,27 nmol/g væv) (Figur 25).
Figur 24. Koncentrationen af dopamin (DA) og 5-hydroxytryptamin (5-HT) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 25. Koncentrationen af noradrenalin (NA), dopamin (DA) og 5-hydroxytryptamin (5-HT) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Koncentration af aminosyrer med signalfunktion: I Figur 26 og 27 ses koncentrationen af aminosyrer med signalfunktion i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Disse to figurer viser, at manebdoseringen ikke påvirkede koncentrationen af taurin, glutamat eller GABA i hverken striatum eller resthjerne.
Figur 26. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling.
Figur 27. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Aktivitet af acetylcholin- og butyrylcholinesterase: I Figur 28, 29 og 30 ses aktiviteten af enzymerne AChE og BuChE i corpus striatum, resthjerne og plasma. Manebdosering påvirkede ikke AChE aktiviteten i corpus striatum, hvorimod BuChE aktiviteten blev forøget i denne hjernedel ved højeste dosis (3,70±0,68 U/g væv) i forhold til kontrol (3,17±0,21 U/g væv) (Figur 28). Manebdosering øgede aktiviteten af AChE i resthjerne ved de to højeste doseringer (13,3±0,3; 13,4±0,3 U/g væv) i forhold til kontrol (13,0±0,3 U/g væv), hvorimod kun højeste dosering (1,91±0,09 U/g væv) øgede aktiviteten af BuChE i denne hjernedel i forhold til kontrol (1,83±0,07 U/g væv) (Figur 29). Figur 30 viser, at kun den mellemste manebdosis påvirkede aktiviteten af BuChE i plasma, idet denne var forøget (Kontrol: 228±50 U/L; 15 mg maneb/kg legemsvægt: 275±45 U/L), hvorimod der ikke var nogen effekt på aktiviteten af AChE i plasma.
Figur 28. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 29. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 30. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE) i plasma fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB). Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Kvantificering af α-synuclein og synaptophysin: I Figur 31 og 32 ses koncentrationen af hjerneproteinerne α-synuclein og synaptophysin i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Data vises som koncentrationen i doserede dyr i procent af koncentrationen i kontroldyr. Disse to figurer viser, at manebdosering ikke ændrede koncentrationen af hverken α-synuclein eller synaptophysin i corpus striatum (Figur 31) eller i resthjerne (Figur 32).
Figur 31. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB) udfra western blots målt ved densitometri. Niveauet af α-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling.
Figur 32. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl) eller maneb (MB) udfra western blots målt ved densitometri. Niveauet af α-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Valg af maneb dosis i kombinationsundersøgelsenPå basis af undersøgelsens resultater valgtes en intraperitoneal dosis på 10 mg/kg legemsvægt/uge til kombinatonsundersøgelsen, primært begrundet i graden af vævsskader efter injektion af 7,5 og 15 mg maneb. 5.4 KombinationsundersøgelserPræliminær undersøgelseDe daglige kliniske observationer af dyrene i deres bure viste ingen sundhedsmæssige problemer. Ved den efterfølgende sektion påvistes vævsirritation og betændelsesreaktioner hos en del af de doserede dyr, men i en grad, som ikke udelukkede at foretage kombinationsundersøgelsen med de doser, som var anvendt i den præliminære undersøgelse. KombinationsundersøgelsenKliniske observationer og fund ved sektion: Bedømt ud fra de daglige kliniske observationer af dyrene i deres bure var der ingen sundhedsmæssige problemer. I kontrolholdet blev der fundet en rotte med kryptorchisme (manglende nedsigning af testiklerne til pungen under fosterudviklingen). I holdet doseret med chlorpyrifos alene blev der fundet en død rotte med ascites (væskeophobning) i bughulen og med atrofisk højre testikel. I chlorpyrifos+maneb holdet blev en rotte aflivet på grund af kraftige blødninger fra endetarmen. Efterfølgende sektion afslørede kraftige blødninger i bageste del af tyndtarmen forårsaget af fejlinjektion. I alle hold behandlet med teststofferne blev der fundet varierende grader af injektionsskader forårsaget af de mange doseringer. Der var ingen leverskader. Vægt af dyr, hjerne og andre organer: Tabel 4 viser vægte af dyr, totalhjerne, lever, nyrer, binyrer, testikler, milt og thymus. Ingen dosering påvirkede dyrenes legemsvægt, levervægt eller thymusvægt. Når der blev doseret med manganklorid alene (2,03±0,06 g) reduceredes hjernevægten i forhold til kontrol (2,11±0,06 g). Kombinationsdosering med manganklorid og chlorpyrifos (2,85±0,26 g) øgede nyrervægten i forhold til kontrol (2,68±0,22 g). Der var gennemgribende effekter af dosering på vægten af binyrer, idet alle doseringer med undtagelse af dosering med chlorpyrifos og maneb alene øgede vægten af binyrer (Tabel 4). Miltens vægt blev øget af dosering med manganklorid (1,27±0,27 g) i forhold til kontrol (1,07±0,12 g). Tabel 4: Legems- og organvægte af rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos, intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb eller med kombinationer heraf i 12 uger. Histopatologiske undersøgelser: Da der ikke blev fundet nogen forskelle af biologisk betydning mellem gruppernes hjernevægte, blev der kun gennemført histopatologiske undersøgelser af kontrol hold og holdet doseret med alle tre teststoffer. Dette begrundes også i manglende effekter i de tidligere histopatologiske undersøgelser udført i hjernerne fra dyr doseret med højere doser af de tre enkeltstoffer. Figur 33 viser immunhistokemiske farvninger i substantia nigra for TH, GFAP, TUNEL og α-synuclein samt en kontrolfarvning for TUNEL i brystkirtelvæv, som er positiv for TUNEL farvningen. Der var ikke effekt af kombinationsbehandlingen med manganklorid, chlorpyrifos og maneb på HE- , GFAP-, TH- og TUNEL-farvning i corpus striatum (ikke vist) eller substantia nigra (se Figur 33).
Figur 33. Figurerne viser histopatologiske billeder af kontroldyr (venstre kolonne) og dyr behandlet med blandingen af mangan, chlorpyrifos og maneb (højre kolonne). Alle snit er fra substantia nigra. TH:Tyrosinhydroxylase GFAP: Glial fibrillært surt protein, TUNEL: Specifik farvning for apoptose. Mangankoncentrationer I Figur 34 vises koncentrationen af mangan i corpus striatum, resthjerne og plasma. Generelt blev det ved sammenligning med konrol påvist, at dosering med manganklorid og maneb begge øgede mangankoncentrationen i de undersøgte væv, og at manganklorid øgede vævskoncentrationerne mere end maneb gjorde. Der var samme mønster i doseringernes effekt på mangan-koncentrationen i corpus striatum, resthjerne og plasma. Corpus striatum: Der fandtes specifikt for denne region, at dosering med manganklorid (35,6±3,7 nmol/g væv), manganklorid og chlorpyrifos i kombination (33,0±6,0 nmol/g væv), maneb (14,2±2,2 nmol/g væv), manganklorid og maneb i kombination (36,45,6 nmol/g væv), chlorpyrifos og maneb i kombination (14,6±3,8 nmol/g væv) og kombinationen af manganklorid, chlorpyrifos og maneb (41,81±3,7 nmol/g væv) øgede koncentrationen af mangan i corpus striatum i forhold til kontrol (8,81±0,97 nmol/g væv). Resthjerne: I resthjernen fandtes, at dosering med manganklorid (31,3±4,6 nmol/g væv), manganklorid og chlorpyrifos i kombination (27,7±2,5 nmol/g væv), maneb (13,8±1,5 nmol/g væv), manganklorid og maneb i kombination (33,2±4,6 nmol/g væv), chlorpyrifos og maneb i kombination (13,7±2,5 nmol/g væv) og kombinationen af manganklorid, chlorpyrifos og maneb (32,1±5,3 nmol/g væv) øgede koncentrationen af mangan i corpus striatum i forhold til kontrol (8,66±0,49 nmol/g væv). Kombinationseffekt af manganklorid og maneb i hjerne: Tabel 5 viser den beregnede gennemsnitlige manganklorid- og maneb-inducerede stigning i mangankoncentration i corpus striatum og resthjerne i forhold til kontrol. Tallene viser, at samtidig dosering med manganklorid og maneb øgede mangankoncentrationen i corpus striatum og resthjerne mere, end hvis der kun blev doseret med manganklorid, og at dette må tilskrives manebdoseringen, specielt var denne additive effekt tydelig i corpus striatum efter kombinationsbehandlingen med manganklorid, chlorpyrifos og maneb. Sammenligning af mangankoncentrationer i corpus striatum og resthjerne: Det ses, at mangankoncentrationerne i corpus striatum (8,81±0,97 nmol/g væv) og resthjerne fra kontroldyr (8,66±0,48 nmol/g væv) ikke var forskellige (Figur 34). Figuren viser også, at ingen form for dosering inducerede forskellige mangankoncentrationer i corpus striatum og resthjerne. Plasma: Dosering med manganklorid (250±145 nmol/g væv), manganklorid og chlorpyrifos i kombination (20154 nmol/g væv), maneb (157±44 nmol/g væv), manganklorid+maneb i kombination (220±74 nmol/g væv), chlorpyri-fos+maneb i kombination (146±64 nmol/g væv) og kombinationen af man-ganklorid, chlorpyrifos og maneb (233±85 nmol/g væv) øgede koncentra-tionen af mangan i corpus striatum i forhold til kontrol (83,9±8,4 nmol/g væv).
Figur 34. Koncentrationen af mangan i corpus striatum, resthjerne og plasma fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Tabel 5: Beregnet gennemsnitlig stigning i mangankoncentrationen i forhold til koncentrationen i kontroldyr
Noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer: I Figur 35 og 36 ses koncentrationen af signalstoffer i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Der var reduceret koncentration af dopamin (124±9 nmol/g væv) og 5-HT (2,46±0,28 nmol/g væv) i corpus striatum efter dosering med chlorpyrifos+maneb i forhold til kontrol (dopamin: 142±16 nmol/g væv; 5-HT: 2,87±0,37 nmol/g væv) (Figur 35). Der iagttoges reduceret koncentration af noradrenalin i resthjerne ved dosering med maneb (2,72±0,37 nmol/g væv) og chlorpyrifos+maneb (2,80±0,23 nmol/g væv) i forhold til kontrol (3,04±0,22 nmol/g væv) (Figur 36). Der påvistes reduceret koncentration af dopamin i resthjerne ved kombinationsdosering med chlorpyrifos og maneb (4,68±0,28 nmol/g væv), idet koncentrationen i kontrol var 5,03±0,41 nmol/g væv (Figur 36). Der var flere dosisrelaterede effekter på 5-HT koncentrationen i resthjerne. Der påvistes forøgede koncentrationer af 5-HT i resthjerne som følge af kombinationsdoseringer med manganklorid og chlorpyrifos (3,02±0,29 nmol/g væv), manganklorid og maneb (3,20±0,39 nmol/g væv), chlorpyrifos og maneb (3,14±0,27 nmol/g væv) og manganklorid og chlorpyrifos og maneb (3,10±0,21 nmol/g væv), idet koncentrationen i kontrol var (2,76±0,23 nmol/g væv) (Figur 36).
Figur 35. Koncentrationen af dopamin (DA) og 5-hydroxytryptamin (5-HT) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid(Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 36. Koncentrationen af noradrenalin (NA), dopamin (DA) og 5-hydroxytryptamin (5-HT) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Koncentration af aminosyrer med signalfunktion: I Figur 37 og 38 ses koncentrationen af aminosyrer med signalfunktion i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Der var flere effekter af dosering på aminosyrekoncentrationerne i corpus striatum og resthjerne. Det blev påvist, at koncentrationen af glutamat og taurin i corpus striatum blev reduceret af dosering med maneb (glutamat: 14,8±1,1 nmol/g væv; taurin 17,6±1,5 nmol/g væv) og lidt mindre ved dosering med manganklorid og maneb i kombination (glutamat: 15,1±0,7 nmol/g væv; taurin 18,0±1,1 nmol/g væv) i forhold til kontrol (glutamat: 16,2±1,1 nmol/g væv; taurin 19,7±1,6 nmol/g væv) (Figur 37). Koncentrationen af taurin i resthjerne blev reduceret af maneb (12,5±2,8 nmol/g væv) i forhold til kontrol (14,8±1,4 nmol/g væv) (Figur 38).
Figur 37. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 38. Koncentrationen af taurin (Tau), glutamat (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Aktivitet af acetylcholin og butyrylcholinesterase: Figurerne 39, 40 og 41 viser aktiviteten af enzymerne AChE og BuChE i corpus striatum, resthjerne og plasma. Der var markante, doseringsrelaterede effekter på cholinesterase aktiviteterne i både corpus striatum, resthjerne og plasma. Generelt reduce-redes aktiviteten af begge enzymer ved enhver dosering med chlorpyrifos. For hvert væv gælder specifikt: Corpus striatum: I forhold til kontrol (59,3±5,8 U/g væv) blev aktiviteten af AChE i corpus striatum reduceret af chlorpyrifos (11,8±3,2 U/g væv), manganklorid og chlorpyrifos i kombination (9,81±2,21 U/g væv), maneb (50,9±8,4 U/g væv), manganklorid og maneb i kombination (53,1±4,4 U/g væv), chlorpyrifos og maneb i kombination (11,7±3,7 U/g væv) og mangan-klorid, chlorpyrifos og maneb i kombination (12,3±3,9 U/g væv) (Figur 39). Samme mønster af effekter påvistes på BuChE aktiviteten, dog ikke ved dosering med maneb alene og ved kombinationsbehandling med mangan-klorid og maneb (Figur 39). Resthjerne: I forhold til kontrol (AChE: 11,60,4 U/g væv; BuChE: 1,83±0,10 U/g væv) blev aktiviteten af AChE og BuChE i resthjerne reduceret af chlor-pyrifos (AChE: 3,63±0,73 U/g væv; BuChE: 0,986±0,079 U/g væv), mangan-klorid og chlorpyrifos i kombination (AChE: 2,87±0,61 U/g væv; BuChE: 0,934±0,074 U/g væv), chlorpyrifos og maneb i kombination (AChE: 3,67±0,90 U/g væv; BuChE: 0,989±0,068 U/g væv) og ved kombinationsbehandling med manganklorid, chlorpyrifos og maneb (AChE: 3,44±0,61 U/g væv; BuChE: 0,994±0,059 U/g væv) (Figur 40). Plasma: I forhold til kontrol (645±96 U/L) blev aktiviteten af AChE i plasma reduceret af manganklorid (544±94 U/L), chlorpyrifos (304±72 U/L), manganklorid og chlorpyrifos i kombination (249±40 U/L), chlorpyrifos og maneb i kombination (293±68 U/L) og af kombinationsbehandling med manganklorid, chlorpyrifos og maneb (288±67 U/L) (Figur 41). Samme mønster af effekter blev påvist på BuChE aktiviteten, dog ikke ved dosering med manganklorid (Figur 41).
Figur 39. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE)) i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 40. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE)) i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05).
Figur 41. Enzymaktiviteten af acetylcholinesterase (AChE) og butyrylcholinesterase (BuChE)) i plasma fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. * Angiver statistisk signifikant forskellig fra kontroldata (P<0,05). Kvantificering af α-synuclein og synaptophysin: I Figur 42 og 43 ses koncentrationen af hjerneproteinerne α-synuclein og synaptophysin i henholdsvis corpus striatum og resthjerne. Data vises som koncentrationen i doserede dyr i procent af koncentrationen i kontroldyr. Disse to figurer viser, at ingen dosering ændrede koncentrationen af hverken α-synuclein eller synaptophysin i corpus striatum (Figur 42) eller resthjerne (Figur 43).
Figur 42. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i corpus striatum fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger udfra western blots målt ved densitometri. Niveauet af α-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Corpus striatum var poolet i alle grupper. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling.
Figur 43. Kvantitative målinger af α-synuclein og synaptophysin i resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid (Mn) i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos (CH), intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb (MB) eller med kombinationer heraf i 12 uger udfra western blots målt ved densitometri. Niveauet af α-synuclein og synaptophysin er i % af kontrolholdet. Data præsenteres som gennemsnit ±standardafvigelse. Der var 10 dyr i alle grupper. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Plasma prolaktin koncentration: I Tabel 6 ses koncentrationen af hormonet prolaktin i plasma. Data vises som koncentrationen i doserede dyr i procent af koncentrationen i kontroldyr. Der var ingen ændring af prolaktinkoncentrationen i plasma som følge af doseringen, hvilket er i overensstemmelse med, at der ikke iagttoges reduceret dopaminkoncentration i corpus striatum eller resthjerne (Figur 35 og 36). Tabel 6: Koncentrationen af prolaktin i plasma fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos, intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb eller med kombinationer heraf i 12 uger. Angives i procent af kontrol.
Tabellen angiver gennemsnit standardafvigelse. Antallet af dyr var 10 i hver gruppe. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Caspase-3 aktivitet: Tabel 7 viser aktiviteten af det apoptoserelaterede enzym caspase-3. Aktiviteten var ikke detekterbar i corpus striatum fordi den lå under apparaturets detektionsgrænse. Der var ingen effekt på caspase-3 aktiviteten i resthjerne som følge af nogen dosering (Tabel 7). Tabel 7: Enzymaktiviteten af caspase-3 i corpus striatum og resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos, intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb eller med kombinationer heraf i 12 uger.
Tabellen angiver gennemsnit standardafvigelse. Antallet af dyr var 10 i hver gruppe. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling. Aktivitet af glutamat decarboxylase: I Tabel 8 ses aktiviteten af enzymet GAD i corpus striatum og resthjerne. Der var ingen effekt af nogen behandling på aktiviteten af GAD i hverken corpus striatum eller resthjerne. Tabel 8: Enzymaktiviteten af glutamatdecarboxylase (GAD) i corpus striatum og resthjerne fra rotter doseret intraperitonealt dagligt i 12 uger med vehikel (kontrol, 0,9% NaCl), intraperitonealt dagligt med manganklorid i 12 uger, subkutant 1 gang om ugen i 12 uger med chlorpyrifos, intraperitonealt 1 gang om ugen i 12 uger med maneb eller med kombinationer heraf i 12 uger.
Tabellen angiver gennemsnit standardafvigelse. Antallet af dyr var 10 i hver gruppe. Data blev testet for varianshomogenitet og normalfordeling.
|
