Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 95 – Virkningsmekanismer for neurotoksisk effekt af mangan og kombinationseffekt af mangan og chlorpyrifos og maneb

Virkningsmekanismer for neurotoksisk effekt af mangan og kombinationseffekt af mangan og chlorpyrifos og maneb

6 Diskussion

6.1 Manganundersøgelser
6.2 Chlorpyrifosundersøgelser
6.3 Manebundersøgelser
- Dose-range undersøgelsen
- Sammenfatning vedrørende virkningsmekanismer
6.4 Kombinationsundersøgelsen

Der blev undersøgt effekter forårsaget af dosering med mangansalte, chlorpyrifos, maneb og kombinationer heraf på parametre, som hver især er biomarkør for påvirkning af specifikke dele af rottens centralnervesystem. Derved blev effekter på størstedelen af centralnervesystemet dækket. Påviste effekter må betragtes som tidlig varsling af neurotoksisk effekt (Østergaard et al. 1983; Ladefoged et al. 2001). Effekter påvist i mangan-, prolaktin-, signalstof-, aminosyre-, α-synuclein- og synaptophysinkoncentrationer samt i AChE og BuChE aktiviteter skønnes at vedvare mindst så længe dosering pågår. Derimod kan ændringer i GFAP, caspase-3 aktivitet og TUNEL-farvning være forbigående og derfor problematiske at ”fange”, hvis ikke det mest optimale tidspunkt vælges (Ladefoged et al. 2000; Lam et al. 2000a,b).

6.1 Manganundersøgelser

Mangandioxid er tungtopløseligt, og det var oprindeligt tilsigtet at udnytte dette, således at tilstedeværelsen af tungtopløseligt mangandioxid i bughulen skulle sikre langvarig, kontinuert manganabsorption mellem doseringerne.

Inden dose-range undersøgelsen blev der foretaget nogle præliminære undersøgelser med det formål at identificere den maksimale dosis mangandioxid, som kunne tolereres af rotterne. Trods fund af irritation i bughulen som følge af doseringen, blev det vurderet ud fra dyrenes sundhedstilstand, at højeste mulige dosering med mangandioxid var 1,22 mg/kg legemsvægt/dag i mindst 4 uger.

Dose-range undersøgelsen

Denne undersøgelse havde til formål at undersøge betydningen af manganspeciering og -doseringsvarighed på mangans neurotoksicitet, at klarlægge virkningsmekanismer herfor og at fastsætte mangandosering i kombinationsundersøgelsen. Der blev doseret intraperitonealt med to forskellige mangansalte - mangandioxid og manganklorid - i doser på henholdsvis 1,22 og 2,5 mg mangan/kg legemsvægt/dag i 8 eller 12 uger.

Manganklorid blev valgt, fordi det i litteraturen er rapporteret, at dette er det mest toksiske af de to mangansalte (ASTDR 2000). Nyere undersøgelser viser også, at toksiciteten in vitro vurderet ud fra dannelsen af ROS er størst for manganklorids vedkommende (Erikson et al. 2004a). Netop dette er betydningsfuldt, fordi induktion af ROS dannelse er relevant for udviklingen af Parkinsons sygdom (Dexter et al. 1989; Betarbet et al. 2000; Junn & Mouradian 2001; Panet et al. 2001).

Et betydningsfuldt fund i undersøgelsen var, at Mn2+-ionen virkede ekstremt lokalirriterende ved intraperitoneal injektion. Dette er ikke beskrevet i litteraturen på trods af, at der er udført adskillige undersøgelser med intraperitoneal injektion i højere doser end dose-range undersøgelsens (ASTDR 2000).

Mangankoncentrationer: Det blev påvist, at dosering med mangandioxid og manganklorid øgede mangankoncentrationen i corpus striatum og resthjerne i forhold til kontrol (Corpus striatum: 8,01±2,02; resthjerne: 6,72±0,53 nmol/g væv). For både corpus striatums og resthjernens vedkommende medførte 12 ugers dosering med begge salte (Corpus striatum. MnO₂: 12,6±3,3; MnCl₂: 21,7±5,1 nmol/g væv. Resthjerne. MnO₂: 13,9±2,8; MnCl₂: 23,9±4,8 nmol/g væv) ingen yderligere ophobning end efter 8 ugers behandling (Corpus striatum. MnO₂: 14,8±1,8; MnCl₂: 26,6±5,3 nmol/g væv. Resthjerne. MnO₂: 11,8±0,8; MnCl₂: 22,4±3, nmol/g væv). Dette viste, at der var opnået mætning af kapaciteten for ophobning af mangan under de benyttede doseringsbetingelser allerede efter 8 ugers behandling. Begge mangansalte forårsagede øget plasmakoncentration af mangan, hvis der blev doseret i 12 uger (MnO₂: 513±62; MnCl₂: 249±53 pmol/L) i forhold til dosering i 8 uger (MnO₂: 153±24; MnCl₂: 191±53 pmol/L) (Tabel 3). Dette antyder, at mekanismen til eliminination af mangan via leveren nåede sin maksimale kapacitet allerede efter de første 8 ugers dosering. At dette ikke gav anledning til forøget koncentration i hjernen, kan skyldes, at blod-hjerne barrieren effektivt beskyttede hjernen for influx af yderligere mængder mangan.

Nyere undersøgelser har studeret mangans neurotoksicitet og virkningsmekanismen herfor, når mangan blev doseret alene eller sammen med pesticider (Normandin et al. 2002; Erikson & Aschner 2003; Zhang et al. 2003a,b; Erikson et al. 2004a). Ligeledes er det undersøgt, hvorledes manganspecieringen ved inhalationsdosering påvirker hjernekoncentrationen (Normandin et al. 2004). Fælles for disse undersøgelser er, at koncentrationen af mangan regionalt kan øges i forhold til kontrol ved såvel inhalationsdosering som oral dosering. Dette er i lighed med, hvad der blev påvist i dose-range undersøgelserne af mangan og af det manganholdige pesticed: maneb. Dette understøtter således anvendelsen af intraperitoneal dosering som alternativ til inhalationsdosering.

I den oprindelige undersøgelse beskrevet af Roels et al. (1997) blev der doseret intraperitoneal med mangandioxid og manganklorid begge i en dosis på 1,22 mg mangan/kg legemsvægt/dag. Mangankoncentrationerne i corpus striatum var ca. 13 og 9,3 nmol/g væv (aflæst og omregnet fra figur) ved dosering med henholdsvis mangandioxid og manganklorid. Dette er i overensstemmelse med dose-range undersøgelsen, hvori der også blev doseret med 1,22 mg mangan som mangandioxid men med 2,5 mg mangan som manganklorid dog i 8 uger, og hvor de striatale mangankoncentrationer da var henholdsvis 14,8 og 26,6 nmol/g væv.

Det kan konkluderes, at mangandosering øgede mangankoncentratonen i rottehjernen, hvilket er en nødvendig forudsætning for induktion af neurotoksicitet.

Noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer: Der blev påvist en 10,5% reduceret dopaminkoncentration i corpus striatum som følge af dosering med MnCl₂ i 12 uger (83,1±7,1 nmol/g væv) i forhold til kontrol (92,9±9,6 nmol/g væv). Denne reduktion var lille og vurderes ikke at kunne give anledning til åbenbare neurotoksiske effekter. Basis for denne vurdering er sammenligning med den dramatiske 97% reducerede striatale dopamin koncentration i dyr, som fik 6-OHDA (2,97±5,15 nmol/g væv) (Figur 4) og deres sundhedstilstand samt det faktum, at patienter med Parkinsons sygdom skal have hen ved 80% reduktion i antallet af dopaminerge neuroner i corpus striatum, førend kliniske symptomer bliver åbenbare. Undersøgelsen påviste derfor ikke nogen entydig mekanisme som involverede dopamin.

Den påviste 10,5% reduktion i striatal dopaminkoncentration kunne ikke eftervises i kombinationsundersøgelsen. Den tilgængelige litteratur dokumenterer forskellige effekter på dopamin koncentrationen, den overvejende effekt er reduktion specielt i corpus striatum, hvilket er vist i mus, rotter og aber (Autissier et al. 1982; Gianutsos & Murray 1982; Bird et al. 1984; Kawata 1990; Komura & Sakamoto 1992; Ingersoll et al. 1995). I en enkelt undersøgelse er der imidlertid også vist øget dopamin koncentration (Ali et al. 1985) mens to andre ikke påviste effekt på dopamin koncentrationen (Witholt et al. 2000; Baek et al. 2003). En samlet, overordnet vurdering af data viser, at mangandoseringsregimen og manganspeciering er meget centrale for absorption, fordeling og effekt af mangan i hjernen (ATSDR 2000), og at der ved den rette absorption og fordeling i hjernen synes at ske en reduktion af dopamin koncentrationen (ATSDR 2000).

Dose-range undersøgelsen påviste også manganinducerede ændringer i 5-HT koncentrationen i corpus striatum efter dosering med mangandioxid i 8 (3,07±0,39 nmol/g væv) og 12 uger (2,91±0,50 nmol/g væv) og dosering med manganklorid i 12 uger (2,20±0,25 nmol/g væv) i forhold til kontrol (2,58±0,40 nmol/g væv). Disse ændringer var små og vurderes derfor ikke at kunne give anledning til åbenbare neurotoksiske effekter.

Koncentration af aminosyrer med signalfunktion: Koncentrationen i corpus striatum af glutamat (7,79±0,87 mol/g væv), taurin (11,2±1,0 mol/g væv) og GABA (1,44±0,23 mol/g væv) faldt ved dosering med manganklorid i 12 uger i forhold til kontrol (glutamat: 10,3±1,5; taurin: 16,4±5,4 og GABA: 2,02±0,51 mol/g væv), hvilket ikke blev genfundet i kombinations-undersøgelsen.

Nyere undersøgelser påviser forskellige effekter af mangandosering på disse aminosyrer, hvilket forklares ved forskel i doseringsregimen og dosisstørrelse (Erikson & Aschner 2003). Disse undersøgelser poienterer, at det GABAerge nervesystem synes mere sårbart overfor mangan end det dopaminerge, og at effekterne ses tidligere i det GABAerge system. Det er vist, at manganinducerede ændringer af glutaminerg og GABAerg funktion kan bidrage til ændret striatal dopamin metabolisme (Page et al. 2001; Castro & Zigmond 2001) og derved indirekte føre til ændret dopaminerg funktion (Erikson & Aschner 2003).

Det er bemærkelsesværdigt, at koncentrationen af alle tre aminosyrer faldt. Imidlertid er faldene så små, at de vurderes ikke at kunne give anledning til åbenbare neurotoksiske effekter.

Aktivitet af acetylcholinesterase: Aktiviteten af AChE faldt i corpus striatum (32,0±3,1 U/g væv) og resthjerne (8,43±0,24 U/g væv), men ikke i plasma efter 12 ugers dosering med MnCl₂, i forhold til kontrol (Corpus striatum: 40,2±10,8; resthjerne: 9,12±0,56 U/g væv).

Disse små fald påvirkede ikke dyrenes sundhedstilstand, fordi det meget større chlorpyrifos-inducerede fald påvist i dose-range undersøgelsen heller ikke gjorde det.

Ekspression af α–synuclein eller synaptophysin: Der var ingen manganinduceret effekt på ekspressionen af α–synuclein eller synaptophysin. Da α-synuclein er biomarkør for Parkinsons sygdom, er manglende effekt på denne parameter i overensstemmelse med det manglende konsistent mønster af effekter. Uændret synaptophysin ekspression antyder, at antallet af kontaktpunkter mellem nervecellerne ikke var ændret, hvilket ellers skulle forventes som tidligt tegn på neurodegeneration.

Prolaktinkoncentration i plasma: Der var ingen ændring i koncentrationen af prolaktin i plasma fra dyrene doseret i 12 uger med 2,5 mg Mn/kg legemsvægt/dag. Da det var i disse dyr, der blev demonstreret reduceret dopamin koncentration i corpus striatum kunne den hypotetiske sammenhæng mellem mangan-reduceret dopamin koncentration i corpus striatum og øget prolaktin koncentration i plasma ikke understøttes.

Supplerende undersøgelser med højere doser manganklorid og supplement i drikkevand

Den forholdsvis lille reduktion i dopamin koncentrationen understregede, at det var vigtigt at dosere med så store doser af manganklorid som muligt. Der blev derfor doseret med manganklorid intraperitonealt i doser på 2,5, 5,0 og 7,5 mg Mn/kg legemsvægt/dag. De to højeste doser fremkaldte organskader, primært i lever og testikler. Supplement af manganklorid i drikkevand kunne øge neurotoksiciteten af den intraperitoneale injektion, specielt hvis de homeostatiske reguleringsmekanismer i mave-tarmkanalen blev overskredet. Det blev derfor forsøgt ved at supplere den intraperitoneale dosering med 2,5 mg Mn/kg legemsvægt/dag med manganklorid via drikkevand i koncentrationer på 5 og 15 g/L. Den laveste koncentration på 5 g/L påvirkede tydeligt dyrenes sundhedstilstand og 15 g/L var for udtalt levertoksisk.

Sammenfatning vedrørende virkningsmekanismer

Dosering med manganklorid i doser på 2,5 mg Mn/kg legemsvægt/dag i 12 uger var det højeste doseringsregimen, dyrene kunne udsættes for ved intraperitoneal injektion. Et yderligere supplement af mangan via drikkevand var ikke muligt.

Det var netop dosering med manganklorid i doser på 2,5 mg Mn/kg legemsvægt/dag i 12 uger, som forårsagede de fleste neurokemiske effekter. Derfor valgtes dette doseringsregimen til kombinationsundersøgelsen.

Dosering med mangansalte medførte opkoncentrering af mangan i hjernen, hvilket er en nødvendig forudsætning for induktion af neurotoksicitet.

De påviste reducerede straitale dopamin, glutamat og GABA koncentrationer og acetylcholinesterase aktivitet efter 12 ugers dosering med manganklorid afspejler generel, omfattende effekt på hjernen. Der blev dog ikke identificeret nogen entydig mekanisme, som involverede dopamin eller nogen af de andre undersøgte parametre, som kunne tænkes at give anledning til sundhedsmæssige problemer. Det kan alligevel konkluderes, at der blev påvist forøgede mangankoncentrationer i hjernen og flere ændringer i koncentrationer af stoffer med signalfunktion, hvilket traditionelt opfattes som tidlig varsling af neurotoksikologisk effekt (Ladefoged et al.1991; Østergaard et al. 1993).

6.2 Chlorpyrifosundersøgelser

Inden dose-range undersøgelsen var det nødvendigt at gennemføre en præliminær undersøgelse til fastsættelse af doseringsregie.

Præliminær undersøgelse

Doseringen med chlorpyrifos blev valgt på basis af en undersøgelse publiceret af Huff et al. i 2001. Projektets undersøgelser viste, at det var muligt at injecere chlorpyrifos subkutant i nakkeregionen een gang om ugen i 12 uger i doser på 15 og 30 mg/kg legemsvægt. Udover kliniske inspektioner, som ikke viste sundhedsmæssige problemer ved dosering, valgtes cholinesterase aktivitet som effektparameter, da organophosphater som chlorpyrifos hæmmer cholinesterase aktivitet. Begge doser hæmmede striatal cholinesterase aktivitet som indikation på chlorpyrifos nåede frem til corpus striatum

Dose-range undersøgelsen

Denne undersøgelse havde til formål at identificere mulige virkningsmekanis-mer for chlorpyrifos’ neurotoksicitet og at fastsætte dosisforhold i kombinationsundersøgelsen.

Der blev doseret subkutant i nakkeregionen med doser på 2,5, 15 eller 30 mg/kg legemsvægt en gang om ugen i 12 uger. Dette gav ikke anledning til kliniske indikationer på komprommiteret sundhedstilstand. Der var enkelte spredte effekter på vægt af nyrer og binyrer, men intet bemærkelsesværdigt.

Histokemi og immunhistokemi: Cellemorfologi, TUNEL farvning og farvning for caspase-aktivitet påviste ikke indikationer på neurodegeneration, herunder induktion af ROS og apoptose. I litteraturen findes ingen relevante undersøgelser af effekten af chlorpyrifos på induktion af oxidativt stress i voksne dyrs hjerner.

Noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer: Chlorpyrifos havde ikke effekt på koncentrationen af noradrenalin i corpus striatum eller resthjerne. Det var bemærkelsesværdigt, at chlorpyrifos øgede koncentrationen af dopamin i corpus striatum ved de to laveste doser(128±14; 132±16 nmol/g væv), men ikke ved den højeste (116±17 nmol/g væv) i forhold til kontrol (113±21 nmol/g væv). Ved dosering øgedes resthjernens 5-HT koncentration ved alle tre doser på en dosisrelateret måde (2,94±0,25; 3,21±0,38; 3,24±0,45 nmol/g væv) i forhold til kontrol (2,45±0,35 nmol/g væv).

Der er kun publiceret lidt omkring chlorpyrifos’ effekt på det dopaminerge og noradrenerge system. Det er påvist, at chlorpyrifos reducede dopamins optagelse i striatale synaptosomer efter 2 ugers dosering (Karen et al. 2001; Bloomquist et al. 2002) og reducede noradrenalin og dopamin turnover (Slotkin et al. 2002). Der er også rapporteret øget dopamin turnover (Karen et al. 2001). Det er ikke umiddelbart muligt at se, hvorledes disse fund kan forklare undersøgelsens resultater.

De påviste generelle chlorpyrifos inducerede stigninger i dopamin og 5-HT koncentrationer i henholdsvis striatum og resthjerne var bemærkelsesværdige, specielt da der i resthjernen var tale om ændringer forenelige med dosis-response. Ændringerne var dog så små, at de ikke antages at give anledning til toksikologiske problemer.

Koncentration af aminosyrer med signalfunktion: Doseringen med chlorpyrifos ændrede ikke koncentrationen af glutamat, taurin eller GABA. Intet tydede således på, at det glutaminerge eller GABAer system blev påvirket af chlorpyrifos, hvilket der heller ikke er dokumentation for i litteraturen.

Cholinesterase aktiviteter: Chlorpyrifos inducerede dosis-relateret reduktion i aktiviteten af AChE i corpus striatum (Figur 18), resthjerne (Figur 19) og plasma (Figur 20). Der var også dosisrelateret reduktion i aktiviteten af BuChE i resthjerne (Figur 19) og plasma (Figur 20). Dette vides at være en generel effekt hos organophosphatholdige pesticider som chlorpyrifos. Den højeste dosis chlorpyrifos gav reduktioner af AChE aktiviteten til henholdsvis 23% og 35% i corpus striatum og resthjerne i forhold til kontrolværdierne. Dette demonstrerede kraftig påvirkning af hjernens cholinerge system, men det er almindeligt kendt, at sådan reduktion ikke nødvendigvis påvirker dyrene sundhedstilstand (Jacobsen et al. 2004).

Ekspression af α–synuclein eller synaptophysin: Der var ingen effekt på ekspressionen af α–synuclein eller synaptophysin. Da α-synuclein er biomarkør for Parkinsons sygdom, er manglende effekt på denne parameter i overensstemmelse med, at chlorpyrifos ikke reducerede, men øgede dopaminkoncentrationen i corpus striatum. Den uændrede synaptophysin ekspression antydede, at chlorpyrifos ikke ændrer antallet af kontaktpunkter mellem nervecellerne, hvilket skulle forventes hvis der var tegn på neurodegeneration.

Sammenfatning vedrørende virkningsmekanismer

Der blev påvist flere effekter på koncentrationen af stoffer med signalfunktion, hvilket traditionelt opfattes som tidlig varsling af neurotoksikologisk effekt (Ladefoged et al. 1991; Østergaard et al. 1993). Det var bemærkelsesværdigt, at chlorpyrifos øgede koncentrationen af dopamin i corpus striatum.

Der var signifikante effekter af alle doser af chlorpyrifos på aktiviteten af AChE i corpus striatum. Undersøgelsen var således velegnet til valg af chlorpyrifos dosis i kombinationsundersøgelsen. På basis af undersøgelsens dosis-effekt forløb for hæmning af AChE aktiviteten valgtes en ugentlig subkutan chlorpyrifosdosis på 15 mg/kg legemsvægt til kombinationsundersøgelsen, da denne dosis også ville kunne ”plads” til kombinationseffkter i begge retninger.

6.3 Manebundersøgelser

Inden dose-range undersøgelsen var det nødvendigt at gennemføre en præliminær undersøgelse til fastsættelse af doseringsregie. På basis heraf udførtes dose-range undersøgelsen.

Dose-range undersøgelsen

Formålet med denne undersøgelse var at identificere mulige virkningsmeka-nismer for manebs neurotoksicitet og at fastsætte dosisforhold i kombinationsundersøgelsen.

Der blev doseret intraperitonealt med 0; 7,5; 15 og 30 mg maneb/kg legemsvægt/uge i 12 uger. Da en dosis på 10 mg maneb/kg legemsvægt ækvivelerer en mangandosis på 2,1 mg manganion/kg legemsvægt svarer den ugentlige mangandosering som 30 mg maneb kun til 36% af den ugentlige mangandosis med manganklorid. Ved sektionen var der imidlertid rester af ikke absorberet maneb i bughulen, hvilket viste kontinuert absorption i løbet af ugen, hvilket modsvarer menneskers langtidsdosering med mindre doser.

Vægt af dyr,hjerne og andre organer: Det mest bemærkelsesværdige fund var, at manebdosering dosisrelateret øgede miltens vægt (1,17±0,19 g; 1,18±0,14 g; 1,22±0,14 g) i forhold til kontrol (0,98±0,10 g). Dette var foreneligt med effekt på immunsystemet, hvilket ikke er publiceret for manebs vedkommende, men bør undersøges nøjere i andet regi.

Histkemi og immunhistokemir: Cellemorfologi, TUNEL farvning og farvning for caspase-aktivitet påviste ikke indikationer på neurodegeneration, herunder induktion af ROS og apoptose. I litteraturen findes ingen relevante undersøgelser af effekten af maneb på induktion af oxidativt stress i voksne dyrs hjerner.

Mangankoncentrationer: Der blev ikke foretaget mangananalyser i resthjernen. Det var bemærkelsesværdigt, at dosering med maneb så markant øgede koncentrationen af mangan i corpus striatum (17,6±2,3; 20,7±5,9; 30,4±8,7 nmol/g væv) på en dosisrelateret måde i forhold til kontrol (11,5±3,7 nmol/g væv). Mangankoncentrationen i striatum var højere efter dosering med højeste dosis maneb (30,4±8,7 nmol/g væv) end efter dosering med manganklorid i 8 (26,6±5,3 nmol/g væv) og 12 (21,±5,1 nmol/g væv) uger, selvom den ugentlige dosis mangan med maneb kun udgjorde 36% af mangandosis med manganklorid, hvilket kunne tolkes som forskellig toksikokinetik for de to manganspecies, endskønt dette ikke umiddelbart synes at kunne forklare den store forskel. Mangan i hjernen måltes som uorganisk mangan efter foraskning. Derved ødelagdes alt organisk materiale, så der ikke kunne opnås information om mangans eventuelle organiske speciering. Der kunne derfor ikke specificeres om iagttagne effekter forårsaget af manebdosering skyldtes manganionen per se eller en eventuel organisk speciering af mangan. Under alle omstændigheder burde den dokumenterede dosis-respons sammenhæng undersøges nærmere, herunder i hvilken konformation og speciering mangan findes i hjernen efter maneb-dosering.

Resultaterne dokumenterede tydeligt, at oprindeligt maneb-specieret mangan passerer blodhjernebarrieren. Alt andet lige vil der være en forøget risiko for at udvikle neurodegenerative lidelser i bl.a. corpus striatum og tidligere debut af Parkinsons sygdom ved ophobning af mangan uanset manganspeciering (Rasmussen et al. 2004).

Noradrenalin, dopamin og 5-hydroxytryptamin koncentrationer: Undersøgelsen viste ikke effekter på koncentrationen af noradrenalin eller dopamin i corpus striatum eller resthjerne. Andre undersøgelser viser imidlertid, at manebdosering kan inducere efflux af dopamin fra striatum og derved bidrage til reduceret dopamin koncentration (Zhang et al. 2003a) og dopaminerg neurodegeneration, når maneb doseres alene (Zhou et al. 2004) og i kombination med paraquat (Fitsanakis et al. 2002; Thiruchelvam et al. 2000a,b; Thiruchelvam et al. 2003). Disse uoverensstemmelse mellem litteraturens og dose-range undersøgelsens resultater er svære at forklare. Dyreetiske aspekter begrænsede muligheden for at øge manebdosis i dose-range undersøgelsen. Højere manebdoser kunne via øget koncentration af mangan reducere dopamin koncentration i corpus striatum, hvilket dose-range undersøgelsen for mangan netop viste. Dette kunne være en mulig forklaring af uoverensstemmelsen.

Manebdosering øgede 5-HT koncentrationen i corpus striatum (3,09±0,37; 3,10±0,94; 3,20±0,70 nmol/g væv) i forhold til kontrol (2,43±0,29 nmol/g væv) på en måde, som var forenelig med dosis-response. Der påvistes også forøget 5-HT koncentration i resthjernen (2,38±0,18; 2,42±0,24; 2,36±0,27 nmol/g væv) ved alle tre dosisniveauer i forhold til kontrol (2,05±0,27 nmol/g væv). Der var således tydelig effekt på det serotonerge nervesystem. Det er uvist, hvilke sundhedsmæssige manifestationer disse konsistente ændringer af 5-HT niveau kan medføre. Traditionelt opfattes sådanne ændringer som tidlig varsling af neurotoksikologisk effekt (Ladefoged et al. 1991; Østergaard et al. 1993). Der er ingen relevante undersøgelser i laboratoriedyr af effekten af manebdosering på koncentrationen af 5-HT i hjernen.

Koncentration af aminosyrer med signalfunktion: Der var ingen effekter på aminosyrekoncentrationer i corpus striatum eller resthjerne. Dette antyder, at hverken det glutaminerge og GABAerge nervesystem blev påvirket af manebdoseringen. Der findes ingen relevante undersøgelser i laboratoriedyr af effekten af manebdosering på koncentrationen glutamat, taurin eller GABA i hjerner fra laboratoriedyr.

Aktivitet af acetylcholin- og butyrylcholinestease: Der var stigninger i aktiviteten af acetylcholin- og butyrylcholinesterase i corpus striatum og resthjerne, specielt ved højeste dosis. Stigninger ses sjældent og kan ikke umiddelbart forklares på anden måde end øget ekspression af de pågældende enzymer. Den biologiske betydning af sådanne stigninger kendes ikke. Umiddelbart vil øget aktivitet medføre hurtigere hydrolyse af acetylcholin og deraf følgende kortere virkningstid ved receptorerne og reduceret cholinerg aktivitet i nervesystemet. Der findes ingen relevante undersøgelser af effekten af manebdosering på cholinesterase aktiviteter.

Ekspression af α–synuclein eller synaptophysin: Der var ingen effekter på ekspressionen af α–synuclein eller synaptophysin i resthjerne eller corpus striatum. I en ny undersøgelse er det vist, at maneb in vitro i cellekulturer inducerer dannelse af cytoplasmatiske inklusioner, som indeholder α-synuclein (Zhou et al. 2004). Da α-synuclein er biomarkør for Parkinsons sygdom er dose-range undersøgelsens manglende effekt på denne parameter i overensstemmelse med, at maneb ikke reducerede dopaminkoncentrationen i corpus striatum. Uændret synaptophysin ekspression antyder at chlorpyrifos ikke ændrede antallet af kontaktpunkter mellem nervecellerne, hvilket skulle forventes, hvis der var tegn på neurodegeneration.

Sammenfatning vedrørende virkningsmekanismer

Undersøgelsen dokumenterede, at oprindeligt maneb-specieret mangan passerede blodhjernebarrieren og blev opkoncentreret dosis-relateret i corpus striatum. Opkoncentrering af mangan fra maneb er en nødvendig forudsætning for induktion af neurotoksicitet. Der blev påvist flere effekter på koncentrationen af stoffer med signalfunktion specielt for 5-HT’s vedkommende, hvor der var dosis-relateret stigning i corpus striatum. Traditionelt opfattes sådanne ændringer som tidlig varsling af neurotoksikologisk effekt (Ladefoged et al. 1991; Østergaard et al. 1993). Herudover var undersøgelsen velegnet til valg af maneb dosis i kombinationsundersøgelsen. På basis af undersøgelsens resultater valgtes en ugentlig intraperitoneal manebdosis på 10 mg/kg legemsvægt til kombinationsundersøgelsen.

6.4 Kombinationsundersøgelsen

Der findes ingen kombinationsundersøgelser i den tilgængelige litteratur, som undersøger neurotoksisk effekt af kombinationer af mangan, chlorpyrifos og maneb. Dette skyldes udover de mange kombinationsmuligheder også, at sådanne studier er yderst komplicerede, langvarige og dyre at udføre. Der er dog øget interesse og behov for at undersøge kombinationseffekter af pesticider (Miljøstyrelsen 2003).

Kliniske observationer og fund ved sektion

Det var bemærkelsesværdigt, at doseringen med manganklorid inducerede toksiske effekter i form af reduceret hjernevægt (2,03±0,06 g) samt øget vægt af binyrer (0,053±0,007 g) og milt (1,27±0,27 g) (Tabel 4) i forhold til kontrol (Hjerne: 2,11±0,06 g; binyrer: 0,048±0,006 g; milt (1,07±0,12 g). Reduceret hjernevægt kunne ikke bekræftes i undersøgelsen med 8 og 12 ugers dosering med MnO₂ og MnCl₂ (Tabel 1). Det var også bemærkelsesværdigt, at binyrernes vægt generelt var påvirket af dosering. Udover manganklorid, øgedes binyrernes vægte også efter dosering med kombinationer af manganklorid og chlorpyrifos (0,064±0,007 g), manganklorid og maneb (0,054±0,006 g), chlorpyrifos og maneb (0,054±0,009 g) og kombinationen af alle tre stoffer (0,057±0,006 g) i forhold til kontrol (0,048±0,006 g). Dette tolkes som en generel effekt af mangan. Den øgede vægt af binyrer og milt skyldtes antageligt en reaktion på den inflammatoriske tilstand, som opstod i bughulen efter injektion.

Mangankoncentrationer

Doseringerne med manganklorid og maneb øgede mangankoncentrationen i corpus striatum, resthjerne og plasma. Generelt øgede dosering med manganklorid mangankoncentrationerne mere end maneb gjorde, hvilket er i overensstemmelse med, at den ugentlige mangandosis med maneb kun udgør 24% af mangandosis med manganklorid (Figur 34). Sammenligning af resultaterer opnået i de to dose-range undersøgelser for henholdsvis manganklorid og maneb viste højere mangankoncentration i corpus striatum ved dosering med maneb. Dette blev i manebundersøgelsen tolket som mulig forskel i toksikokinetik. Kombinationsundersøgelsen viste dog, at det nok snarere skyldtes, at det var resultater fra to forskellige undersøgelser, som blev sammenlignet.

I Tabel 5 ses, at samtidig dosering med manganklorid og maneb øgede mangankoncentrationen i corpus striatum og resthjerne mere, end hvis der kun blev doseret med manganklorid, hvilket tilskrives manebdoseringen. Specielt var denne additive effekt tydelig i corpus striatum efter kombinationsbehandlingen med manganklorid, chlorpyrifos og maneb.

Det kan konkluderes, at der var en tilnærmet additiv relation mellem mangankoncentration i corpus striatum og doseringerne med manganklorid og maneb.

Effekter på signalstoffer, aminosyrer og cholinesterase aktiviteter

Dosering med manganklorid, chlorpyrifos og maneb i kombinationsunder-søgelsen havde en række effekter på de neurokemiske parametre, i nogle tilfælde var de sammenfaldende med de effekter, som blev påvist i de tre dose-range undersøgelser med disse stoffer, i andre tilfælde ikke.

Dosering med manganklorid alene

Signalstoffer: I kombinationsundersøgelsen påvirkede dosering med manganklorid ikke koncentrationen af dopamin og 5-HT i corpus striatum eller resthjerne. I dose-range undersøgelsen påvistes derimod reduceret koncentration af både dopamin og 5-HT i corpus striatum efter dosering med manganklorid i 12 uger. Som i kombinationsundersøgelsen var der ikke effekt på koncentrationen af noradrenalin eller dopamin i resthjernen.

Aminosyrer: I kombinationsundersøgelsen påvirkede dosering med manganklorid ikke koncentrationen af nogen aminosyre med signalfunktion i corpus striatum eller resthjerne. Dose-range undersøgelsen påviste derimod reduceret koncentration af glutamat, taurin og GABA i corpus striatum efter dosering med manganklorid i 12 uger, hvorimod taurinkoncentrationen steg i resthjernen i modsætning til i kombinationsundersøgelsen.

Cholinesteraser: I kombinationsundersøgelsen påvirkede dosering med manganklorid ikke aktiviteten af acetyl- og butyrylcholinesterase i corpus striatum eller resthjerne. Dose-range undersøgelsen påviste derimod reduceret aktivitet af acetylcholinesterase i både corpus striatum og resthjerne.

Virkningsmekanismer: Som det ses af ovenstående, var der en bemærkelsesværdig generel forskel mellem neurokemiske effekter i corpus striatum induceret af manganklorid i kombinationsundersøgelsen og i dose-range undersøgelsen: Koncentrationerne af dopamin, 5-HT, glutamat, taurin og GABA samt aktiviteten af cholinesteraser faldt generelt i dose-range undersøgelsen, medens der ikke var effekt i kombinationsundersøgelsen. Dette kan ikke umiddelbart forklares endegyldigt, men en mulighed årsag kunne være, at der efter 12 ugers dosering i dose-range undersøgelsen indtraf gliose i corpus striatum, og at dette af ukendte årsager ikke skete i kombinationsundersøgelsen, hvilket understøttes af de histopatologiske undersøgelser i kombinationsunderøgelsen. Ved gliose kunne neuroner - herunderdopaminerge neuroner - i corpus striatum blive erstattet af gliaceller. Gliacellerne ville da bidrage med vægt til corpus striatum, men ville ikke i samme omfang bidrage med dopamin, aminosyrer med signalfunktion og cholinesterase aktivitet, hvilket således kunne forklare de generelle fald i koncentrationer og enzymaktiviteter, selvom corpus striatums vægt ikke var påvirket i forhold til kontrol.

Resultaterne fra kombinationsundersøgelsen og dose-range undersøgelsen viste ingen konsistente effekter på resthjernens koncentration af noradrenalin, dopamin, 5-HT og aminosyrer samt cholinesterase aktiviteter.

Dosering med chlorpyrifos alene

Signalstoffer: I kombinationsundersøgelsen var der ingen effekt på koncentrationen af NA, dopamin eller 5-HT i corpus striatum (Figur 35) eller i resthjernen (Figur 36), når chlorpyrifos blev doseres alene. I dose-range undersøgelsen øgede chlorpyrifos derimod koncentrationen af dopamin i corpus striatum ved dosering med 2,5 og 15 mg/kg (Figur 14), men ikke ved højeste dosis. Disse ændringer kunne imidlertid ikke tillægges nogen biologisk betydning, dels på grund af deres ringe størrelsesorden, dels den kendsgerning, at de ikke blev genfundet i kombinationsundesøgelsen. I dose-range undersøgelsen var der heller ingen ændringer i koncentrationen af noradrenalin i resthjernen (Figur 15). For dopamin’s vedkommende påvistes et fald i koncentrationen i resthjernen ved dosering med 15 mg/kg legemsvægt (Figur 15) og en dosisrelateret stigning i 5-HT koncentrationen ved alle tre doser (Figur 15). Resultaterne fra kombinationsundersøgelsen kunne ikke bekræfte dette, hvorfor kan ikke umiddelbart forklares.

Aminosyrer: I kombinationsundersøgelsen var der ingen effekt af chlorpyrifos på koncentrationen af nogen aminosyre i hverken corpus striatum (Figur 37) eller resthjerne (Figur 38), hvilket er i fuldstændig overensstemmelse med resultaterne fra dose-range undersøgelsen (Figur 26 og 27).

Cholinesteraser: I kombinatrionsundersøgelsen var der reduceret aktivitet af acetylchloinesterase og butyrylcholinesterase i corpus striatum, resthjerne og plasma (Figur 39, 40, 41). Dette understøttes af resultaterne i dose-range undersøgelsen, hvor der blev demonstreret dosisrelateret, markant reduceret AChE aktivitet i corpus striatum (Figur 18), resthjerne (Figur 19) og i plasma (Figur 20) efter 12 ugers dosering med chlorpyrifos.

Virkningsmekanismer: Der blev således påvist fælles, generelle effekter af chlorpyrifos i kombinationsundersøgelsen og dose-range undersøgelsen, idet cholinesterase aktiviteter blev reduceret i corpus striatum, resthjerne og plasma. Herudover viste ingen af de to undersøgelser effekt på nogen aminosyrekoncentration i corpus striatum. Derimod var der forskel i effekt på dopaminkoncentrationen i corpus striatum, som kun kan forklares ved biologisk variation.

Udover de reducerede aktiviteter af cholinesteraser, viste resultaterne fra kombinationsundersøgelsen og dose-range undersøgelsen ingen konsistente effekter på resthjernens koncentration af noradrenalin, dopamin, 5-HT og aminosyrer.

Dosering med maneb alene

Signalstoffer: I kombinationsunderesøgelsen ses, at manebdosering ikke påvirkede dopamin eller 5-HT koncentrationerne i corpus striatum (Figur 35). I resthjernen var der et mindre et fald i noradrenalin koncentrationen (Figur 36), som næppe kan tillægges nogen biologisk betydning. I dose-range undersøgelsen havde manebdosering ikke effekt på koncentrationen af dopamin i hverken corpus striatum (Figur 24) eller resthjerne (Figur 25). Derimod var der en konsistent tilsyneladende svag dosisrelateret mindre stigning af koncentrationen af 5-HT i corpus striatum (Figur 24). En tilsvarende stigning, dog ikke dosisrelateret, blev også set i koncentrationen af 5-HT i resthjernen (Figur 25). Dette antyder, at det serotoninerge system blev påvirket af manebdosering.

Aminosyrer: I kombinationsundersøgelsen reducerede manebdosering koncentrationen af glutamat og taurin i corpus striatum (Figur 37). I resthjernen reduceredes kun taurinkoncentrationen (Figur 38).

Dette var ikke i overensstemmelse med resultaterne i dose-range undersøgelsen, som slet ikke viste effekter på aminosyrekoncentrationerne i corpus stratum eller resthjerne.

Cholinesteraser: I kombinationsundersøgelsen reducerede manebdosering aktiviteten af AChE i corpus striatum (Figur 39). Faldet var imidlertid for lille til at få biologisk betydning. Der var ingen ændringer i hverken AChE eller BuChE aktiviteterne i resthjernen (Figur 40).

I dose-range undersøgelsen havde manebdosering derimod ikke effekt på aktiviteten af AChE i corpus striatum (Figur 28) og gav kun marginale stigninger i resthjernens AChE og BUChE aktiviteter (Figur 29). Der var ingen generel effekt i plasma (Figur 30).

Virkningsmekanismer: Der var forskel på undersøgelsernes effekt på striatale koncentrationer af 5-HT, glutamat og taurin og acetylcholinesterase aktivitet. Disse forskelle i effekter kan ikke umiddelbart forklares ved andet end biologisk variation.

Dosering med manganklorid og chlorpyrifos i kombination

Signalstoffer: I kombinationsundersøgelsen var der er ingen effekt på dopamin og 5-HT koncentrationerne i corpus striatum (Figur 35), hvilket er i overensstemmelse med, at kombinationsundersøgelsens enkeltdoseringer med manganklorid og chlorpyrifos heller ikke viste effekt på striatale dopamin og 5-HT koncentrationer. I kombinationsundersøgelsen steg 5-HT koncentrationen i resthjerne, hvilket også var tilfældet ved doseringen med chlorpyrifos alene (Figur 36), hvorfor kombinationsbehandlingens effekt kan tilskrives chlorpyrifos alene.

Aminosyrer: Som ved enkeltstofdosering med manganklorid og chlorpyrifos var der ingen effekter på koncentrationen af nogen aminosyre i corpus striatum (Figur 37) eller resthjerne (Figur 38).

Cholinesteraser: Ændringerne af aktiviteterne af AChE og BuChE i corpus striatum (Figur 39), resthjerne (Figur 40) og plasma (Figur 41) var konsistente med ændringerne ved dosering med chlorpyrifos alene.

Interaktion: Kombinationsundersøgelsen påviste ingen interaktion mellem manganklorid og chlorpyrifos på neurokemiske effektparametre.

Dosering med manganklorid og maneb i kombination

Signalstoffer: I overensstemmelse med kombinationsundersøgelsens enkeltdoseringer med manganklorid og maneb, var der er ingen effekt på NA, dopamin og 5-HT koncentrationer i corpus striatum ved kombinationsbehandlingen (Figur 35), hvorimod 5-HT koncentrationen i resthjerne var øget (Figur 36), som det også blev påvist ved enkeltdosering med maneb (Figur 36), hvorfor kombinationsbehandlingens effekt i resthjernen kan tilskrives maneb alene.

Aminosyrer: Kombinationsdoseringen sænkede glutamat og taurin koncentrationerne i corpus striatum (Figur 37), men ikke i resthjerne (Figur 38). Sænkningen i glutamat og taurin blev også set ved enkeltdosering med maneb, hvorfor kombinationsbehandlingens effekt på koncentrationen af disse to aminosyrer i corpus striatum kan tilskrives maneb alene.

Cholinesteraser: I corpus striatum var aktiviteten af acetylcholinesterase reduceret (Figur 39), og der var ingen effekt på butyrylcholinesterase aktivitet (Figur 39), hvilket også påvistes ved enkeltdosering med maneb, som således kan forklare kombinationsbehandlingens effekt. Der var ingen effekt på aktivitet af de to cholinesteraser i resthjerne (Figur 40).

Interaktion: Kombinationsundersøgelsen påviste ingen interaktion mellem manganklorid og maneb på neurokemiske effektparametre

Dosering med maneb og chlorpyrifos i kombination

Signalstoffer: I kombinationsundersøgelsen reduceredes koncentrationen af dopamin og 5-HT i corpus striatum (Figur 35). Som ved enkeltstof doseringerne øgede kombinationsdoseringen også 5-HT i resthjerne (Figur 36), hvorimod koncentrationen af noradrenalin og dopamin faldt ved kombinationsbehandling (Figur 36).

Da kombinationsundersøgelsens effekt ved enkeltdosering med maneb og chlorpyrifos var stigninger i koncentrationen af henholdsvis 5-HT og dopamin, var der en tilsyneladende antagonistisk interaktion mellem maneb og chlorpyrifos med hensyn til de påviste reducerede koncentrationer af dopamin og 5-HT i corpus striatum ved kombinationsbehandlingen, hvilket ikke blev påvist i resthjernen.

Aminosyrer: Som ved enkeltdosering med maneb eller chlorpyrifos var der ingen effekt af kombinationen på aminosyrekoncentrationer i corpus striatum (Figur 37) eller resthjerne (Figur 38).

Cholinesteraser: Ændringer i aktiviteterne af AChE og BuChE i corpus striatum og resthjerne (Figur 39 og 40) samt plasma (Figur 41) var konsistente med ændringerne ved dosering med chlorpyrifos alene.

Interaktion: Udover en tilsyneladende samspilseffekt mellem maneb og chlorpyrifos, som medførte til reduceret koncentration af dopamin og 5-HT i corpus striatum, var der ingen interaktion. De reducerede dopamin og 5-HT koncentrationer i corpus striatum er dog så små, at de ikke anses at medføre biologiske effekter.

Dosering med manganklorid, chlorpyrifos og maneb i kombination

Signalstoffer: I corpus striatum var der ingen effekt på koncentrationen af dopamin og 5-HT (Figur 35). 5-HT koncentrationen steg i resthjernen (Figur 36), hvilket er i overensstemmelse med, at kombinationsdoseringen med chlorpyrifos og maneb også inducerede stigning (Figur 36).

Aminosyrer: Kombinationen gav ingen ændringer i aminosyrekoncentrationer i corpus striatum (Figur 37) eller resthjerne (Figur 38). Der kunne forventes en svag kombinationseffekt i corpus striatum med hensyn til koncentrationerne af glutamat og taurin i corpus striatum, fordi der blev påvist et koncentrationsfald efter dosering med kombinationen af manganklorid og maneb (Figur 37). Denne uoverensstemmelse kan umiddelbart kun forklares ved biologisk variation eller ved, at manganklorid antagonistisk ophævede kombinationseffekten af maneb og chlorpyrifos.

Cholinesteraser: Ændringerne af aktiviteterne af AChE og BuChE corpus striatum (Tabel 32), resthjerne (Tabel 33) og plasma (Tabel 33) var konsistente med ændringerne ved dosering med chlorpyrifos alene.

Caspase-3 og GAD aktivitet samt α-synuclein og synaptophysin ekspression: De neurokemiske undersøgelser viste ikke effekt på caspase-3 aktivitet, hvilket var i overensstemmelse med manglende fund i de histopatologiske undersøgelser. GAD-aktiviteten var ikke påvirket, hvilket var i overensstemmesle med uændrede koncentrationer af glutamat og GABA. α-synuclein er biomarkør for Parkinsons sygdom. Neurokemiske undersøgelser viste, at denne parameter ikke var påvirket. Uændret synaptophysin ekspression antydede, at antallet af kontaktpunkter mellem nervecellerne ikke var ændret, hvilket ellers skulle forventes, som tidligt tegn på neurodegeneration.

Interaktion: Der var ingen entydige interaktion ved samtidig dosering med manganklorid, chlorpyrifos og maneb. Den viste samspilseffekt mellem maneb og chlorpyrifos med hensyn til reduceret striatal koncentration af dopamin og 5-HT kunne således ikke eftervises, hvilket ikke udelukker, at manganklorid antagoniserede manebs og chlorpyrifos’ samspilseffelt. Er dette tilfældet, er der også tale om en samspilseffekt, om end det ikke er foreneligt med øget risiko for Parkinsons sygdom .

Plasmaprolaktin koncentration

Der var ingen doseringsrelateret effekt på koncentrationen af prolaktin i plasma. Dette var i overensstemmelse med manglende effekt på dopamin koncentrationen.

Histopatologiske undersøgelser

Undersøgelsen viste ikke ændringer i farvning for tyrosinhydroxylase som markør for effekt på det dopaminerge system, hvilket var i overensstemmelse med de manglende effekter på dopamin koncentrationen målt ved neurokemiske analyser.

En blandt flere sandsynlige mekanismer for mangans neurotoksicitet er induktion af oxidativt stress (Erikson et al. 2004a). Mangan vides at kunne inducere ROS, og bedømt ud fra induktion af ROS påvist i in vitro undersøgelser i Cath.a celler, som er specielt velegnede til undersøgelser af det dopaminerge system, så er manganklorid mere toksisk end mangandioxid (Worley et al. 2002). Oxidativt stress kan føre til neurodegeneration via apoptose. Undersøgelserne viste ingen histopatologiske (morfologi, caspase-3 farvning og TUNEL farvning) indikationer herpå. Dette kunne skyldes, at hjernerne blev undersøgt på et uhensigtsmæssigt stadium af apoptosen. Imidlertid fandtes, som andre også har vist (ASTDR 2000; Zhang et al. 2003b), en reduceret hjernevægt som mulig indikation på neurodegeneration.

Sammenfatning vedrørende virkningsmekanismer

Der blev påvist flere ændringer i koncentrationen af stoffer med signal-funktion (noradrenalin, dopamin, 5-HT, glutamat, taurin, GABA) og aktivitet af acetylcholinesterase, hvilket traditionelt opfattes som tidlig varsling af neurotoksikologisk effekt (Ladefoged et al. 1991; Østergaard et al. 1993).

Vurderet på basis af de målte neurokemiske og histopatologiske parametre blev der ikke påvist entydige virkningsmekanismer for mangan eller maneb i corpus striatum eller resthjerne, hvorimod chlorpyrifos konsistent reducerede aktiviteten af cholinesteraser i både -corpus striatum og resthjernen. Der var en tilsyneladende interaktion mellem maneb og chlorpyrifos i corpus striatum, idet kombinationsbehandling med disse to stoffer reducerede koncentrationerne af både dopamin og 5-HT, dog kun til et niveau som ikke skønnes at få biologisk betydning. Under alle omstændigheder var specielt faldet i dopaminkoncentration i overensstemmelse med relationen mellem fald i striatal dopaminkoncentration og Parkinson’s sygdom. Resultaterne for samtidig dosering med manganklorid, chlorpyrifos og maneb kunne imidlertid ikke bekræfte dette, hvilket kan forklares ved biologisk variation eller ved muligheden af, at manganklorid antagoniserede samspilseffekten af maneb og chlorpyrifos, hvilket i givet fald også er en samspilseffekt.

Der blev ikke påvist histopatologiske forandringer i nærværende undersøgelsesdesign. Dette udelukker dog ikke, at der indenfor de 12 uger kunne have været forbigående induktioner af GFAP ekspression og apoptose, hvilket så ikke kunne registreres ved afslutningen af undersøgelserne efter 12 ugers dosering.

Der blev påvist en interessante interaktion på toksikokinetisk niveau. Dette var interaktionen mellem mangan og maneb, idet resultaterne var forenelige med en svag additiv effekt på ophobning af mangan i hjernen. Såfremt manganophobningen i hjernen har betydning for risiko for udvikling af Parkinsons sygdom, så må det konkluderes, at denne interaktion vil øge risikoen for at udvikle Parkinsons sygdom.