| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Screeningsundersøgelse for campylobacter i vand

Bilag A

Vandkvalitet – Kvalitativ og semikvantitativ påvisning af termotolerante campylobacter.

Introduktion

Campylobacter jejuni subsp. jejuni og Campylobacter coli er hyppigt årsag til tarminfektioner hos mennesker. Campylobacter upsaliensis har muligvis lignende betydning. Campylobacter lari ses sjældnere som årsag til infektioner hos mennesker. Campylobacter overføres oftest fra fødevarer, husdyr, kæledyr eller andre syge personer; men de kan også overføres med overfladevand, hvis dette indtages.

ADVARSEL – Denne standard bør kun benyttes af personer, der er fortrolige med almindelig laboratoriepraksis. Det er brugerens ansvar at sørge for passende sikkerheds- og sundhedsregler og at sikre, at gældende regler efterleves.

1 Emneområde

Denne standard angiver en metode til kvalitativ og semikvantitativ påvisning af termotolerante campylobacter.

Metoden kan anvendes til alle typer vand, der kan filtreres gennem et membranfilter.

BEMÆRK Metoden kan anvendes som en kvalitativ metode for campylobacter i et givet prøvevolumen.

BEMÆRK Der kan fås et mere præcist estimat af campylobacter indholdet i prøven ved at analysere efter et MPN design.

2 Normative referencer

3 Definitioner

I denne standard anvendes følgende definitioner:

Termotolerante campylobacter opsamles på filtre efter filtrering som angivet i afsnit 8.2, opformeres under den selektive opformering beskrevet i afsnit 8.3, danner typiske kolonier under inkubation i selektivt substrat ved forhøjet temperatur som beskrevet i afsnit 8.4, danner ikke synlige kolonier under inkubering i atmosfærisk luft under betingelser som angivet i afsnit 8.6, er stærkt bevægelige, slanke spiralformede stave og bevæger sig i hurtige ryk eller i proptrækkeragtige drejninger.

BEMÆRK Termotolerante campylobacter af betydning for humane infektioner omfatter Campylobacter jejuni subsp. jejuni (herefter omtalt som C. jejuni), C. coli, C. lari og muligvis C. upsaliensis.

BEMÆRK Termotolerante campylobacter er gram-negative, oxidase-positive og katalase-positive (nogle C. upsaliensis angives at være katalase-negative eller svagt positive) buede eller spiralformede stave med en karakteristisk hurtig, og ofte roterende, bevægelse. I blot lidt ældre kulturer optræder coccoide former.

BEMÆRK Campylobacter kræver næringsrige substrater for optimal vækst. De er meget følsomme for skadelige oxidationsprodukter som peroxider og superoxid anioner, der kan opstå, når substrater udsættes for lys og ilt. De er mikroaerofile og foretrækker en atmosfære med ca. 5 % ilt og ca. 10 % CO2. Nogle campylobacter angives at vokse bedst, når atmosfæren også indeholder brint.

BEMÆRK De fleste stammer af C. jejuni, C. coli og C. lari vokser ved temperaturer mellem 32 °C og 45 °C, men nogle stammer vokser ikke under 35 °C, og andre vokser ikke ved temperaturer over 43 °C.

BEMÆRK C. upsaliensis kan muligvis ikke påvises ved de i denne standard beskrevne dyrkningsbetingelser.

4 Princip

Prøven filtreres gennem membranfiltre med porestørrelse 0,45 µm. Filtrene overføres til selektive opformeringsbouilloner, der inkuberes i (44 ± 4) timer ved (37 ± 1) °C i modificeret atmosfære. Efter inkubationen udstryges fra hver bouillon på overfladen af et selektivt, fast substrat, mCCDA, der inkuberes i (44 ± 4) timer ved (41,5 ± 1) °C i modificeret atmosfære. Kolonier, der kan være campylobacter, undersøges for vækst under aerobe forhold. Isolater, der ikke vokser aerobt, undersøges ved fasekontrast mikroskopi og evt. ved enkelte, biokemiske reaktioner. Se flow diagram i bilag A.

Hvis der findes typiske campylobacter, er der påvist termotolerante campylobacter i prøven. Resultatet angives som et semikvantitativt estimat, se bilag B.

BEMÆRK Vand, der ikke lader sig filtrere, kan undersøges ved at pode vandprøven direkte i opformeringsbouillon. Forholdet mellem prøven og opformeringsbouillonen bør højst være 10 %.

BEMÆRK Hvis der er et højt indhold af campylobacter i prøven, kan prøvemateriale uden forudgående opformering udstryges på mCCDA agar.

5 Apparatur

5.1 Inkubatorer der kan holde (37 ± 1) °C og (41,5 ± 1) °C.

5.2 Udstyr til membran filtrering, jævnfør ISO 8199.

5.3 Membranfiltre

Sterile membranfiltre af celluloseester med en diameter på 45 – 50 mm og en porestørrelse på 0,45 µm. Tilsvarende filtre med porestørrelse 0,22 µm til sterilisering af reagenser.

5.4 Udstyr til mikroaerob inkubation

Tætte beholdere, der kan vedligeholde en modificeret atmosfære under inkubationerne, udstyret med ventiler til udsugning og indblæsning. Vakuum pumpe. Udstyr til at kontrollere atmosfærens sammensætning, ANOXOMAT eller tilsvarende. En passende gasblanding af kvælstof, ilt, kuldioxid og om muligt brint.

Alternativt kan anvendes gas-generende pakker, forudsat de kan etablere og vedligeholde en atmosfære med ca. 5 % ilt, ca. 10 % kuldioxid og helst også ca. 10 % brint.

5.5 Fasekontrast-mikroskop

5.6 Flasker, 150 - 250 ml, med lufttætte skruelåg

5.7 Petriskåle med ribber, sterile, 9 cm

5.8 Almindeligt laboratorieudstyr

6 Substrater og reagenser

Alle ingredienser og kemikalier skal være af anerkendt kvalitet, ”for microbiology” eller bedre.

Vand skal være destilleret eller af tilsvarende kvalitet, jævnfør ISO 3696, Grade 3.

Følg instruktionerne i bilag C.

Der kan med fordel anvendes kommercielt tilgængelige tørsubstrater, forudsat de svarer til ingrediensfortegnelserne i bilag C. De skal fremstilles efter fabrikantens anvisninger.

7 Prøvetagning, transport og opbevaring

Campylobacter er meget følsomme for skadelige påvirkninger. Det er derfor vigtigt, at prøverne holdes kolde ((3 ± 2) °C) og beskyttet mod lys, indtil de er blevet filtrerede, og filtrene anbragt i opformeringsbouillonerne. Generelle prøvetagningsbetingelser er omtalt i ISO 19 458. For Campylobacter er det særlig vigtigt at undgå opblanding med luft, ligesom prøver skal filtreres snarest muligt efter prøvetagning. Om nødvendigt kan prøverne opbevares i indtil 30 timer før filtrering.

BEMÆRK Campylobacter holder sig godt i rent vand ved (3 ± 2) °C. Ved højere temperaturer og i andre væsker henfalder de hurtigt.

8 Fremgangsmåde

8.1 Generelt

Medtag altid en positiv kontrolstamme podet i enten prøvemateriale eller i sterilt vand, filtreret, opformeret og udsået parallelt med prøverne, dels for at kunne dokumentere, at alle trin i analysen virker tilfredsstillende, dels for at have frisk referencemateriale til rådighed ved identifikationen af campylobacter (afsnit 8.5 og 8.6).

Analyser hver prøve dobbelt, således at der opformeres både i den stærkt selektive Preston bouillon (C.1.1) og i den mindre selektive Bolton bouillon (C.1.2).

BEMÆRK Preston bouillon er for selektiv til at tillade fremvækst at alle C. coli. Bolton bouillon er for svagt selektiv til at undertrykke ledsagefloraen i alle typer prøvemateriale. Hvis der ikke er tilstrækkeligt prøvemateriale vælges den bouillon, der vurderes bedst egnet til undersøgelsen. For prøver med en kraftig baggrundsflora er Preston bouillon bedst egnet. For prøver med ringe baggrundsflora er Bolton bouillon bedre egnet.

BEMÆRK Mængderne af prøvemateriale, der skal analyseres, afhænger af prøvematerialets sammensætning og undersøgelsens formål. I bilag B er angivet relevante prøvemængder ved analyse af drikkevand og af spildevand.

8.2 Membranfiltrering

Filtrer de relevante mængder prøvemateriale (jævnfør bilag B) gennem sterile 0,45 µm membranfiltre (5.3). Tilstræb mindst mulig kontakt med luftens ilt, bl.a. ved at undgå at suge luft gennem filtrene efter at prøven er filtreret. Overfør filtrene til opformeringsbouilloner straks efter filtreringen.

Hvis prøven indeholder meget opslemmet materiale, kan det være nødvendigt at anvende to eller flere filtre til de største prøvevolumina. Alle disse filtre overføres til samme portion opformeringsbouillon. Brug af forfilter (”filter aid”) kan også være en hjælp ved filtreringen af sådanne prøver. ”Filter aid” er beskrevet i ISO 8199.

8.3 Opformering

Opvarm opformeringsbouillonerne (C.1.1, C.1.2) til 20 - 30 °C, inden de podes.

Overfør filtrene (8.2) til hver sin 100 ml portion opformeringsbouillon straks efter de enkelte filtreringer. Anbring de podede bouilloner med løst låg eller uden låg i beholdere (5.4). Luk beholderne og modificer luften derinde (5.4). Anbring derefter beholderne ved (37 ± 1) °C i (44 ± 4) timer.

BEMÆRK Der anvendes 100 ml opformeringsbouillon pr. filter for at opnå tilstrækkelig fortynding af ledsagefloraen til, at denne ikke hæmmer campylobacternes vækst.

BEMÆRK Nogle laboratorier har med held opformeret campylobacter uden brug af mikroaerofil atmosfære (5.4). I stedet har de anvendt tæt tillukkede flasker eller rør, der har været omtrent fyldt med bouillon. En sådan procedure vil kræve omhyggelig standardisering for at udelukke falsk negative resultater på grund af suboptimale forhold under opformeringen.

BEMÆRK Preston Campylobacter Selektivt Supplement (C1.1.2) indeholder antibiotika som er kendt som relativt giftige over for C. coli og over for subletalt beskadigede C. jejuni (Polymyxin B og Rifampicin). I overensstemmelse hermed har nogle forskere fundet, at præ-inkubering i 4 timer i Preston bouillon uden selektivt supplement kan forbedre påvisning af campylobacter i vand, som kun indeholder få andre mikroorganismer. Bolton bouillon indeholder ingen af de antibiotika, som er kendt for at være toksisk for campylobacter.

BEMÆRK Nogle af de termotolerante campylobacter vil uddø eller vokse for langsomt, hvis inkubations-temperaturen ligger under 36 °C.

8.4 Udstrygning på fast, selektivt substrat

Tag flasker med opformering forsigtigt op af beholderne efter inkubering for at undgå at hvirvle bundfald med baggrundsflora op.

BEMÆRK Hvis der forventes et stort antal campylobacter, kan der udstryges allerede efter (21 ± 3) timer. Der skal dog i alle tilfælde udstryges efter endt opformering (8.3).

Overfør med et sterilt podeøje ca. 10 µl podekultur til overfladen af mCCDA plader (C.2). Udtag podekulturen lige under overfladen af opformeringsbouillonen og udstryg på pladens overflade.

Sæt straks efter podning pladerne i beholdere (5.4), med modificeret atmosfære (5.4) ved (41,5 1) °C i (44 4) timer.

BEMÆRK Pladerne viser oftest synlig vækst efter (21 ± 3) timers inkubering. Negative plader skal inkuberes yderligere 24 timer i modificeret atmosfære (5.4).

BEMÆRK Der er beskrevet teknikker, der udnytter campylobacters store bevægelighed til at befri dem for ledsageflora. En eller flere dråber prøvemateriale anbringes på et 0,45 µm eller 0,65 µm cellulose acetat membranfilter, der er placeret på et fast, nonselektivt substrat (f.eks. basalsubstratet til mCCDA (C.2.1)). Pladen med filter inkuberes ved 37 °C i 0,5 til 24 timer i modificeret atmosfære. Efter at filteret er fjernet, inkuberes substratet i (21 ± 3) timer, således at campylobacter, der har arbejdet sig gennem filteret ned til substratet, danner synlige kolonier. I stedet for prøvemateriale kan der anvendes koncentrat fra centrifugering (5 000 g i 10 minutter) af opformeringer.

8.5 Aflæsning

Aflæs pladerne (8.4) for synlig vækst efter inkubering.

Campylobacter danner efter 24 – 48 timers vækst oftest ret små, flade eller konvekse kolonier med skinnende overflade. Kolonierne har en tendens til at sprede sig langs udstrygningslinierne. Veladskilte kolonier minder om små væskedråber. På fugtige plader kan der i stedet ses en tynd film.

Skrab i tvivlstilfælde materiale fra pladernes overflade til undersøgelse for typisk udseende (8.6.1), eller fortsæt inkuberingen i endnu et døgn.

Kolonimateriale af campylobacter har på podeøjet typisk en flødefarvet til lysebrun farve.

Efter fortsat inkubering ændres campylobacter kolonierne til lavt konvekse med et mat skær. Ofte udvikles der tillige metalskær. Koloniernes farve varierer fra farveløs til grålig eller hvidlig.

8.6 Bekræftelse

8.6.1 Vækst på non-selektive agar plader

Husk under de efterfølgende undersøgelser, at campylobacter hurtigt kan skades ved udsættelse for lys og luft.

Subkultiver campylobacter-lignende kolonier fra mCCDA på overfladen af to næringsrige, non-selektive agarplader (basalsubstratet til mCCDA (C.2.1), nutrient agar med eller uden tilsætning af 5 % blod (C.1.1.4), Mueller-Hinton agar eller anden non-selektiv agar, der er fundet velegnet til at understøtte campylobacters vækst). Den ene af pladerne inkuberes aerobt, den anden i modificeret atmosfære (5.4) ved (41,5 1) °C i (21 3) timer.

Campylobacter vokser ikke aerobt.

Bekræft tilstedeværelsen af campylobacter i kolonier fra pladen inkuberet i modificeret atmosfære ved fasekontrast mikroskopi (8.6.2). Hvis der ses typiske campylobacter (8.6.2), kan resultatet rapporteres, jævnfør afsnit 10. I tvivlstilfælde fortsættes med de supplerende undersøgelser beskrevet i bilag D.

8.6.2 Bevægelighed og cellemorfologi

Opslem kolonimateriale i en næringsrig bouillon som Preston basalsubstrat (C.1.1.1) på et objektglas. Læg et dækglas over og mikroskoper straks under anvendelse af fasekontrast og 1 000 ganges forstørrelse.

Campylobacter er stærkt bevægelige, slanke, spiralformede stave. Bevægelserne kan både være pileagtigt hurtige og proptrækkeragtigt roterende.

Campylobacter kan gøres ubevægelige ved at opslemme dem i vand i stedet for Preston basalsubstrat. Herved kan deres typiske udseende ofte bedre iagttages.

BEMÆRK Alternativt til fasekontrast mikroskopi kan campylobacters cellemorfologi iagttages ved mørkefeltmikroskopi eller efter farvning med 2 % carbolfuchsin i 5 minutter. Gram-farvning af campylobacter giver ofte et utilfredsstillende resultat.

8.7 Verifikation

Hvis der ønskes yderligere verifikation, sendes isolater til et laboratorium med erfaring i artsbestemmelse og i typebestemmelse ved hjælp af fænotypiske metoder eller molekylære metoder.

Da campylobacter let dør ud under skadelige påvirkninger, er det vigtigt ved forsendelser at følge de instruktioner, der kan gives fra det erfarne laboratorium.

9 Kvalitetssikring

Laboratoriet skal have et velfungerende kvalitetssikringssystem således at det til stadighed kan dokumenteres, at apparatur, substrater, reagenser og fremgangsmåde er optimale for undersøgelsen. Brugen af positive kontrolstammer er en del at dette system.

Campylobacter jejuni ATCC 35 918 eller ATCC 35 919 og Campylobacter coli ATCC 33 559 eller 43 133 er egnede som positive kontrolstammer i denne metode.

10 Angivelse af resultater

Hvis tilstedeværelsen af typiske campylobacter er bekræftet (8.6), er prøven fundet positiv for termotolerante campylobacter.

Termotolerante campylobacter er påvist i et givet testvolumen, hvad enten der påvises campylobacter i den ene eller begge selektive opformeringer fra dette testvolumen.

Ud fra resultatet af undersøgelser af forskellige volumina af prøvemateriale, rapporteres et semikvantitativt estimat af prøvens indhold af termotolerante campylobacter, jævnfør bilag B.

11 Analyserapport

Analyserapporten skal indeholde følgende oplysninger:

1. en henvisning til denne standard;
2. de nødvendige oplysninger til entydigt at identificere prøven;
3. analyseresultatet, udtrykt som angivet i afsnit 10;
4. særlige forhold under analysen og enhver afvigelse fra eller modificering af den i denne standard foreskrevne fremgangsmåde, som kan have haft indflydelse på analyseresultatet.

Bilag A

(informativt)

Flow diagram over metoden

Prøvevolumina på 2*10 ml, 2*100 ml og 2*1 000 ml

Filtrering gennem 0,45 µm filtre

• 6 parallelle filtreringer af de seks volumina
  • Filtre fra filtrering af 10 ml, 100 ml og 1 000 ml i hver sin portion af Preston bouillon
  • Filtre fra filtrering af 10 ml, 100 ml og 1 000 ml i hver sin portion af Bolton bouillon

Opformering i 48 timer ved 37 °C fra de seks filtre i hver sin bouillon

Overførsel af opformering fra hver flaske til hver sin plade med mCCDA.

• Overførsel fra hver af de seks flasker til hver sin plade

Inkubering i modificeret atmosfære i 48 timer ved 41,5 °C

Isolation på nonselektivt substrat. Kontrol af, at der ikke ses vækst i atmosfærisk luft.

• Overførsel fra hver plade med synlig vækst til to nye plader. Den ene plade fra hvert par inkuberes i atmosfærisk luft, den anden i modificeret atmosfære

Undersøgelse af bevægelse og cellemorfologi

• Overførsel fra hver af skålene fra inkuberingerne i modificeret atmosfære til dækglas med en dråbe væske. Fasekontrast mikroskopi.

Yderligere identifikation og/eller karakterisering, hvis nødvendigt

Rapportering af det semikvantitative resultat

Footnotes

[1] Under udarbejdelse

[2] Under udarbejdelse

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Marts 2006, © Miljøstyrelsen.